高产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建和发酵优化

刘合栋, 江南大学 发表时间:2013-06-01 硕士

来源于指孢囊菌的脯氨酸4-羟化酶,可直接在游离的L-脯氨酸的第4位上加羟基,生成反式-4-羟脯氨酸。为了使脯氨酸4-羟化酶基因在大肠杆菌中得到高表达并实现L-脯氨酸高效转化,根据大肠杆菌密码子偏好性,重新设计合成了脯氨酸4-羟化酶基因。经密码子优化后的脯氨酸4-羟化酶基因与初始基因序列比较,脯氨酸4-羟化酶基因密码子适用指数CAI从初始的0.3992调整为0.9941,接近于最优值1,且GC百分比含量降低至59.34%。利用软件预测初步优化的脯氨酸4-羟化酶基因mRNA二级...


产反式-4-羟基-L-脯氨酸大肠杆菌菌株的改造及发酵条件初步研究

张胜利, 江南大学 发表时间:2015-06-01 硕士

反式-4-羟基-L-脯氨酸是自然界中分布最普遍的一种羟脯氨酸,在医药、化工、食品和美容业等领域均有广泛应用。本文以已构建好的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株——大肠杆菌BL21(DE3)/p UHT4为出发菌,在添加外源脯氨酸生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的前提下,对该菌进行菌种改造及发酵用培养基的优化,以期提高生产效率,降低生产成本。具体研究内容如下:在质粒p UHT4的基础上,构建出脯氨酸-4-羟化酶基因与透明颤菌血红蛋白基因(vgb基因)的共表达质粒p UHVT4,...


产顺式-3-羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建及发酵优化

姚雪娜, 江南大学 发表时间:2015-06-01 硕士

顺式-3-羟基-L-脯氨酸(顺式-3-羟脯氨酸)能够用于合成很多抗癌药物,具有重要的商业价值,但其在自然界中含量极为稀少,各国研究者都在寻找一种经济有效的获取顺式-3-羟脯氨酸的方法。来源于链霉菌TH1的脯氨酸-3-羟化酶可以直接在游离的L-脯氨酸第三位碳原子上加羟基,生成顺式-3-羟脯氨酸。本研究通过目的基因优化设计,重组大肠杆菌的构建,发酵优化等策略,使脯氨酸-3-羟化酶基因(P3H)在大肠杆菌中大量表达,实现L-脯氨酸高效转化为顺式-3-羟脯氨酸脯氨酸-3-羟化酶基...


枯草芽孢杆菌L-脯氨酸异源延伸途径研究

吴志勇, 江南大学 发表时间:2017-06-01 硕士

微生物通过引入外源脯氨酸-4-羟化酶基因(p4h),转化游离的L-脯氨酸发酵合成反式-4-羟脯氨酸(HYP)。然而,仅通过菌株自身提供的前体L-脯氨酸无法满足反式-4-羟脯氨酸的稳定合成,外源添加L-脯氨酸虽能一定程度上满足其合成的需求,但成本较高。本文在枯草芽孢杆菌中架构了反式-4-羟脯氨酸生物合成途径,通过对其L-脯氨酸合成途径相关基因功能探究分析,成功提升了细胞自身L-脯氨酸合成能力,为反式-4-羟脯氨酸的高效合成奠定了基础。本文主要研究内容与结果如下:(1)构建了组...


无外源L-脯氨酸产反式-4-羟脯氨酸大肠杆菌的构建及发酵优化

胡丹丹, 江南大学 发表时间:2015-06-01 硕士

反式-4-羟基-L-脯氨酸是L-脯氨酸羟基化后的产物,在医药、化工、食品、美容等行业中应用广泛。将微生物体内L-脯氨酸的生物合成途径与脯氨酸4-羟化酶催化的羟基化反应结合起来,在无外源L-脯氨酸的条件下直接从葡萄糖转化生成反式-4-羟脯氨酸,可以节约生产成本,充分利用微生物资源。首先,构建L-脯氨酸生物合成能力增强的重组大肠杆菌:通过全质粒PCR对克隆得到的pro BA中的pro B进行定点突变,突变的氨基酸位点是E143A、K145A;选择色氨酸串联启动子驱动突变基因的表...


高植物蛋白替代饲料不同水平鱼粉后添加羟脯氨酸对大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)幼鱼生长性能的影响

刘运正, 中国海洋大学 发表时间:2014-06-06 硕士

...物蛋白替代饲料中不同水平的鱼粉后,分别添加晶体羟脯氨酸,研究其对大菱鲆生长性能和肌肉质构等相关指标的影响。实验设计了7组等氮等能的饲料,以含鱼粉60%的饲料为对照组(FM),以小麦粉、豆粕、玉米蛋白、谷朊粉、花生粕和啤酒酵母按照一定比例混合作为复合植物蛋白分别替代其中40%(40I)、50%(50I)和60%(60I)鱼粉后作为其中三个处理组,另在三个替代水平饲料中分别添加了0.6%羟脯氨酸(Hyp)形成40IHyp、50IHyp和60IHyp三个处理组,实验共7个处理组。...


L-羟脯氨酸-Zn(Ⅱ)的配合机制及其抗氧化性研究

左瑞雅; 周小华; 杜首英, 生物工程学报 2007年04期 , 期刊

以L-羟脯氨酸(Hyp)和ZnSO4制备Hyp-Zn(Ⅱ)配合物,研究其配合机制及抗氧化能力。与L-羟脯氨酸相比,配合物在1100cm-1处出现了一新的红外吸收峰,说明L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生了配位作用;配合物的差热-热重图与L-羟脯氨酸相比,在290℃和375℃的吸热峰消失了,确证L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生了配位作用;配合物核磁核磁共振图中3.5~3.9ppm的羧基氢和羟基氢的信号峰的消失,表明L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生配合的位置是L-羟脯氨酸的α碳的羧基或γ碳的...


生物转化法生产顺式-4-L-羟脯氨酸的研究

赵利维, 河北师范大学 发表时间:2016-03-21 硕士

顺式-4-L-羟脯氨酸(cis-4-Hydroxy proline,cis-4-Hyp)不属于20种常见的氨基酸,是L-脯氨酸被顺式-4-L-羟化酶羟基化修饰后的产物。顺式-4-L-羟脯氨酸是合成宜他霉素和微鞘藻素两种肽类抗生素的原料,并且临床上被认为可做为抗癌药物,因此cis-4-Hyp的生产和应用一直受到业界的广泛关注。目前,国外生产羟脯氨酸的有效生产方法是生物转化法,即利用脯氨酸羟化酶在Fe2+、α-酮戊二酸存在的介质中将底物L-脯氨酸转化为L-羟脯氨酸。本研究首先通...


产顺式-4-羟脯氨酸枯草芽孢杆菌工程菌的构建及发酵优化

张博文; 陈可泉; 曹伟佳; 王昕, 食品工业科技 2017年13期 , 期刊

顺式-4-羟脯氨酸(CHOP)是一种重要的手性结构物质,可广泛用于药物以及香料制造。本研究为开发CHOP的生物合成方法,将来源于中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的L-脯氨酸-4-羟化酶在枯草芽孢杆菌WB800N中实现了成功表达,构建获得了能够以L-脯氨酸为底物合成CHOP的工程菌株,进而对该菌株的发酵条件以及发酵组分进行了优化研究。结果表明:工程菌株的最适发酵温度为25℃,最适诱导剂浓度为1 mmol/L,最适发酵p H为5;在发酵体系中加入5 m...


产反式-4-羟基-L-脯氨酸菌株代谢途径的改造

王晓姣, 江南大学 发表时间:2017-06-01 硕士

反式-4-羟基-L-脯氨酸(简称:反式-4-羟脯氨酸,trans-4-Hydroxyproline,P4H)在医药健康、化学合成、食品以及美容等领域有广泛应用,受到了国内外研究者的关注。随着生物科技蓬勃发展,微生物法生产反式-4-羟脯氨酸的技术逐步成熟,国外已将该法用于反式-4-羟脯氨酸的工业生产,国内关于该方法的研究甚少。近年来,本课题组成功构建了一株在无外源L-脯氨酸添加条件下产反式-4-羟脯氨酸的菌株,但产量较低。本文拟通过多基因共表达、基因敲除、发酵优化及补料发酵等...


L-脯氨酸结晶过程研究

王坤坤, 河北科技大学 发表时间:2015-06-01 硕士

L-脯氨酸是生物有机体的重要组成部分,属于人体非必需氨基酸。L-脯氨酸生产工艺主要有:化学合成法,明胶水解法和发酵法。在明胶水解生成L-羟脯氨酸工艺过程的废水中含有L-脯氨酸95%(质量分数)左右,L-羟脯氨酸5%(质量分数)左右。L-羟脯氨酸和L-脯氨酸结构相似,物化性质极相近,国内外尚无低成本回收L-脯氨酸技术,大都将其作为废水进行处理,造成资源浪费的同时又增加了环境治理成本。为了回收废水中的L-脯氨酸,本文对L-脯氨酸的结晶热力学、结晶动力学和结晶工艺进行了系统研究,...


反式-4-羟基脯氨酸基因工程菌的构建及摇瓶发酵工艺优化

刘笑尘, 湖南农业大学 发表时间:2016-06-01 硕士

反式-4-羟脯氨酸为手性亚氨基酸,是一种被广泛应用于医疗美容,化工,畜牧领域的生产原料。本文构建了一株能够高效表达反式-4-脯氨酸羟化酶基因的重组大肠杆菌,并对得到的重组菌株DH5α/pUC-19-pH进行了摇瓶发酵工艺优化,主要结果如下:1,优化反式-4-脯氨酸羟化酶编码区序列:使用JCAT软件优化了反式-4-脯氨酸羟化酶的编码区基因序列,改变了141个碱基(替换了138个同义密码子),使其CAI指数由0.3965优化至0.9277,C/G比由73.6263%优化至59....


α-酮戊二酸对L-羟脯氨酸产量的影响

蔡萌萌; 刘子强; 户红通; 陈宁; 徐庆阳, 中国酿造 2018年07期 , 期刊

微生物合成L-羟脯氨酸时需要α-酮戊二酸的参与,而细胞内α-酮戊二酸的含量有限,限制了L-羟脯氨酸的高效合成。因此该实验通过在L-羟脯氨酸发酵过程中外源添加α-酮戊二酸,来考察α-酮戊二酸对发酵菌体生长、L-羟脯氨酸产量、糖酸转化率和代谢流的影响。结果表明,α-酮戊二酸对菌体生长有一定的抑制作用,但在一定浓度范围内,外源添加α-酮戊二酸能有效提高L-羟脯氨酸的产量和糖酸转化率,当随糖流加5 g/L(初始发酵液)α-酮戊二酸时,L-羟脯氨酸产量能够达到最大值62.14 g/L...


活细胞在线监控L-羟脯氨酸补料发酵工艺的研究

蔡萌萌; 户红通; 刘子强; 徐庆阳; 陈宁, 食品与发酵工业 2018年05期 , 期刊

为了研究活细胞在线监控补料技术对L-羟脯氨酸发酵的影响,在30 L发酵罐上安装活细胞在线检测仪,实时监测发酵液中活细胞数量,根据活细胞数量调整补料策略,分析活细胞在线监控补料对L-羟脯氨酸发酵补糖速率、产量、糖酸转化率和代谢流量分布的影响。结果表明,采用活细胞在线监控补料发酵工艺生产L-羟脯氨酸的最佳补糖策略是在发酵中后期及时降低补糖速率,最终降到9 g/(L·h),L-羟脯氨酸产量提高了11.39%,乙酸积累量减少了48.69%,糖酸转化率提高了14.92%,糖酵解途径和...


乳糖诱导脯氨酸羟化酶高效表达研究

马乐辉; 李存会, 煤炭与化工 2018年07期 , 期刊

研究了乳糖诱导重组大肠杆菌表达脯氨酸羟化酶与L-脯氨酸生物转化。结果表明,将种子液按1%的比例接种于含有0.8%乳糖发酵培养基中,在28℃、140 r/m条件下,培养约2 h,在分光光度计波长为600 nm,OD值为0.6~0.8条件下,再诱导培养13 h,离心收集菌体,按质量体积比1 g∶100 m L(菌体量∶转化液)向菌体中加入转化液,在28℃条件下能高效进行L-脯氨酸转化生成L-羟脯氨酸,转化率达到98.6%。本研究为L-脯氨酸生物转化实现工业化生产奠定了基础。...


鱼鳞中羟脯氨酸的测定

张俊杰; 曾庆孝, 淮海工学院学报(自然科学版) 2004年01期 , 期刊

用比色法测定鱼鳞中的羟脯氨酸 ( Hyp) ,具有较好的稳定性和较高的回收率。鱼鳞经过脱钙处理 ,羟脯氨酸的保留率为 96.1 9% ,经过第一次提取胶原蛋白后 ,提取率达到了总胶原蛋白的 70 %以上 ,同样的条件下进行第二次提胶 ,二次胶原蛋白的提取率较低...


sucA缺失型大肠杆菌菌株的构建与发酵条件优化

林凡; 张震宇; 孙付保; 于林, 食品与生物技术学报 2018年08期 , 期刊

反式-4-羟脯氨酸在多领域具有重要应用价值。为了进一步提高反式-4-羟脯氨酸的产量,在已构建好的E. coli BL21(DE3)△putA的基础上,敲除基因sucA的同时插入密码子优化后的反式-4-羟化酶基因(hyp),并将构建好的质粒pUC19-ptrp2-hyp-vgb导入该基因敲除菌株中。之后在摇瓶水平上,单因素优化发酵条件与发酵培养基的组分,并通过正交实验进一步确定敲除菌株的培养条件。结果表明:与含有同样质粒的原菌和两种单敲除菌E. coli BL21(DE3)△...


产3-羟脯氨酸重组菌的构建及发酵优化

姚雪娜; 张震宇; 孙付保; 陈昶; 黄建华; 沈松, 食品与生物技术学报 2017年03期 , 期刊

顺式-3-羟基-L-脯氨酸(顺式-3-羟脯氨酸)可用于合成多种抗癌药物,具有重要的商业价值,目前大多通过添加IPTG来诱导表达脯氨酸-3-羟化酶,采用两步法生物合成顺式-3-羟脯氨酸。作者通过目的基因优化设计,引入强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)来避免异源表达时的诱导剂使用,构建重组质粒p ES-Ptrp2-P3H,成功构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)/p ET21a-Ptrp2-P3H,优化后的脯氨酸-3-羟化酶基因(P3H)改变了168个碱基,GC含量由原来的...


鱿鱼皮胶原蛋白的测定与回收

秦玉青; 刘承初; 王慥, 上海水产大学学报 2002年02期 , 期刊

... ,确立了适宜于鱿鱼皮中胶原蛋白含量测定 (以羟脯氨酸计 )的方法。结果表明 ,在测定鱿鱼皮中胶原蛋白的含量时 ,宜先将鱿鱼皮进行脱脂处理 ,然后再直接水解测定羟脯氨酸。就水解条件而言 ,可分别采用 12 0℃水解 12h或 130℃水解 6h代替ISO 3496E方法中的 10 5℃水解 16h ,以缩短水解时间。其次 ,采用酶法促溶和热水提取的方法对鱿鱼皮中胶原蛋白进行回收利用 ,以胶原蛋白回收率为依据 ,得出胃蛋白酶 5℃酶解 72h和 10 0℃水提 6h分别为酶法...


反式-4-羟基-L-脯氨酸的研究进展

朱亚娟; 彭青; 陈艳; 张振宇; 柳鹏福; 吴杰群; 储消和, 发酵科技通讯 2018年02期 , 期刊

反式-4-羟基脯氨酸是胶原蛋白中特有的一种氨基酸,在动物体内具有重要的生理功能与独特的生物活性,广泛地应用于医药、化工、美容、疾病诊断等领域.介绍了反式-4-羟基脯氨酸的代谢、功能和应用,并着重对反式-4-羟基脯氨酸的生产方法进行综述,在此基础上探讨了生产反式-4-羟基脯氨酸的研究方向,为利用全细胞催化法和发酵法生产反式-4-羟基脯氨酸提供参考依据,同时展望了未来工业化生产反式-4-羟基脯氨酸发展方向....


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