利用染色体步移PCR检测辐射松的单核苷酸多态性

李伟; 李慧; 陈晓阳; WU Harry, 西北植物学报 2007年08期 , 期刊

染色体步移技术(chromosome walking)的基本原理以辐射松(Pinus radiata)肌动蛋白基因(actin)为例,利用获得的EST序列设计定向引物,向上游和下游进行了染色体序列的步移.获得了包括启动子、5′端非编码区和编码区及3′端非编码区辐射松肌动蛋白基因基因组序列2154 bp.通过对200株不同辐射松个体进行PCR扩增及测序,共获得了21个SNPs,其中启动子区域3个,编码区15个,3′端非编码区4个.实验结果为今后染色体步移技术在基因非编码区S...


染色体步移技术研究进展

梁成真; 张锐; 郭三堆, 生物技术通报 2009年10期 , 期刊

染色体步移技术是一种常用的克隆已知片段旁侧序列的技术。综述了近年来染色体步移技术的发展情况,介绍了结合基因组文库的染色体步移技术和基于PCR的染色体步移技术。同时总结了物理剪切法和限制性内切酶法构建亚克隆文库的优化步骤,以及连接成环PCR法、外源接头介导PCR法和半随机引物PCR法的原理,并且比较分析了他们之间的优缺点,以期对实际操作起到借鉴作用。...


利用RFLP数据进行定向染色体步移

刘秋云; JayC.Dunlap, 科学通报 1996年03期 , 期刊

染色体步移是分子遗传学一个十分重要的技术,它在分子克隆上运用得日益广泛.但是,通常我们不能决定染色体步移的方向,从两个方向步移既费时又费力.本文阐述了一个能够确定染色体步移方向的方法.借助于这个方法,在粗糙脉孢霉成功地克隆了os-1基因.这个方法对其它生物也有借鉴意义.os-1突变株对高渗透压敏感,它在含4%氯化钠的固体培养基上不能生长.os-1在表型上与野生型很不相同.os-1突变株的无性孢子聚集成团,并带橘红或紫色.在非允许温度下,一个温度敏感型os-1突变(等位...


染色体步移

方福德, 环境与职业医学 2008年02期 , 期刊

寻找感兴趣基因或DNA片段所在位置的技术。其工作策略和步骤是:先用遗传学分析确定感兴趣基因所在染色体大概位置,然后应用与之连锁的遗传标志作为分子探针,从基因文库中筛出与此标志的5’端和3’端部分重复序列的DNA克隆,再以筛得之DNA克隆去筛选与它们邻接的DNA克隆。这样,...


苦瓜降糖多肽P的基因克隆及其降血糖活性的研究

王碧莲, 华东理工大学 发表时间:2010-12-09 硕士

...得其基因序列信息。本论文利用简并RT-PCR和染色体步移等技术,从苦瓜中克隆得到498 bp成熟多肽P的编码序列,同源比对未发现同源性序列。成功构建了pET32a-polypeptide P原核表达载体,原核表达的重组多肽P经SDS-PAGE电泳分析,该重组多肽分子量约为44 kDa,且90%以上为上清表达。原核表达的多肽P经Ni-NTA亲和柱纯化后能得到单一条带,Western blotting进一步鉴定该蛋白即重组多肽P蛋白。纯化后的重组蛋白经四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠验...


阴沟肠杆菌B8拮抗活性基因‘admA’及上游调控序列的克隆与功能鉴定

朱军莉; 李德葆; 余旭平, 遗传 2012年04期 , 期刊

...沟肠杆菌B8的作用机理,文章采用转座子标签法和染色体步移技术克隆到突变株B8B中Tn5插入位点周边拮抗活性相关片段,并通过基因敲除验证了获得的拮抗相关片段admA’上游调控序列的功能。以转座子中Kan抗性基因为标签,克隆了B8B菌株中Tn5插入位点左侧2 608 bp序列,经两次染色体步移得到Tn5插入位点右侧的2 354 bp序列。序列拼接后获得B8菌株拮抗相关序列4 611 bp的Bcontig。生物信息学分析显示该序列含有7个ORF,分别对应于3-磷酸甘油醛脱氢酶(G...


偏肿革裥菌3个锰过氧化物酶基因的克隆与表达分析

吴书景, 东北林业大学 发表时间:2012-04-01 硕士

...R与RACE等方法获得的3个MnP基因片段,以染色体步移法获得偏肿革裥菌3个MnP基因的DNA全长序列,分别命名为Lgmnp1、Lgmnp2、Lgmnp3(GenBank的登录号分别为:JQ327834, JN571114, JN571116)。3条基因都具有5个内含子,开放阅读框(ORFs)分别为1095bp,1098bp,1101bp,各自编码364,365,及366个氨基酸。Lgmnp1cDNA全长与Trametes versicolor mnp (AJ745879)...


单引物PCR扩增效率及甘蓝型油菜Toc33基因启动子的分离

李熠毅, 四川大学 发表时间:2006-05-01 硕士

...种只用一条引物就可以克隆已知序列侧翼未知区域的染色体步移方法。它利用引物在低严谨条件下会与模板发生错配结合的特性,使一端引物与已知序列退火,而另一端引物则与未知侧翼区的部分相似序列退火来实现完整的PCR扩增。为了研究引物的长短对扩增效率的影响,分别设计了三组长为6、8、10碱基的短引物以及一组19和22碱基的长引物,以甘蓝型油菜基因组DNA为模板进行单引物PCR扩增,用电泳检测扩增产物并割胶回收较明亮的条带,再用巢式PCR鉴定扩增产物和回收产物。电泳结果显示,通过低严谨扩增...


应用于染色体步移的PCR扩增技术的研究进展

刘博; 苏乔; 汤敏谦; 袁晓东; 安利佳, 遗传 2006年05期 , 期刊

各种建立在PCR基础上染色体步移的方法能够根据已知的基因序列得到侧翼的基因序列。染色体步移技术主要应用于克隆启动子、步查获得新物种中基因的非保守区域、鉴定T-DNA或转座子的插入位点、染色体测序工作中的空隙填补,从而获得完整的基因组序列等方面。其方法主要有3种:反向PCR的方法,连接法介导的PCR的方法以及特异引物PCR的方法。文章就各种方法进行举例说明并加以分析比较。...


利用基因组文库加速Xa23基因定位的染色体步移

王春连; 陈乐天; 曾超珍; 张群宇; 刘丕庆; 刘耀光; 樊颖伦; 章琦; 赵开军, 中国水稻科学 2006年04期 , 期刊

...为0.4、0.4、0.4、0.5、0.6、0.6和1.1 cM。虽然69B、70N和81N与Xa23的遗传距离均为0.4 cM,但序列比对揭示69B与70N的物理距离为35 kb,与81N为95 kb,69B距Xa23最近。三者与Xa23的遗传距离虽然相同,但物理距离存在很大差异。这些末端片段标记加密了Xa23基因一侧的遗传图谱,并使其遗传距离缩短到0.4 cM,加速了Xa23的定位进程,为Xa23的分离克隆奠定了重要基础。讨论了这种染色体步移方法的适用条件。...


甘蓝型油菜中可能与ATP 6相互作用的基因的克隆及真核表达载体的构建

余渝, 四川大学 发表时间:2007-05-16 硕士

...长序列。根据RACE的测序结果,设计引物,通过染色体步移的方法进行基因的克隆。测序后,将酵母双杂交的测序结果,RACE的测序结果,以及染色体步移的测序结果进行序列拼接,根据拼接所得到的全长序列设计引物:359-Up-primer:5′-ATG ATG GAT ACT TTC CCT CCT TCG-3′;359-Down-primer:5′-TCA CCA GAA GGG TAA CAA AAC ACA AG-3′,分别以油菜的总基因组DNA和反转的cDNA作为模板,进行基...


基于PCR的染色体步移中单引物扩增的克服与非特异引物的利用

刘春香; 张卫华; 孙小镭, 中国生物化学与分子生物学报 2010年04期 , 期刊

基于PCR的染色体步移(PCR-Walking)方法已有许多种,包括反向PCR、连接介导的PCR、随机引物PCR等.在众多的方法中,经常存在由通用引物引起的单引物非特异扩增现象.本文综述了连接介导的PCR-Walking中单引物扩增的形成原理及克服方法.克服单引物扩增主要是使接头引物在DNA两端的接头上只有1个结合位点,从而避开单引物扩增.常用的方法有3′端加氨基修饰的不对称接头、泡泡状接头或Y字型接头及单寡核苷酸接头等方法.还介绍了2种利用通用引物非特异扩增克隆目的序列的...


嗜水气单胞菌J-1株脂酶性质分析及其克隆表达

巢伟, 南京农业大学 发表时间:2007-05-01 硕士

...单胞菌我国分离鱼源株Ah J-1株为模版,应用染色体步移技术扩增脂酶基因全长,为进一步研究脂酶的功能奠定基础。1.用10kDa的截流滤膜超滤、25%-50%的硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析,获得纯化的嗜水气单胞菌J-1株胞外脂酶,SDS-PAGE显示分子量约为80kDa。该酶最适作用pH值为7.4,最适作用温度为37℃。将纯化的脂酶腹腔注射小鼠后,小鼠无一死亡;纯化的脂酶与HEp-2细胞共培养,不产生细胞病变,表明该酶对动物和细胞无毒性。2.根据已发表的引物序...


早实枳成花相关基因的表达分析及PtFLC的功能特征

王岩, 华中农业大学 发表时间:2010-06-01 硕士

...因为本文所选GA3浓度不合理所致。2.通过两轮染色体步移技术分离得到PtFLC的上游片段1100bp。通过生物信息学分析发现,该段序列具有启动子特有的功能元件,同时还具有应答光周期、低温和GA3等外界环境条件的元件,此外还包含一些有关干旱胁迫的元件。因此,可以初步确定该段序列即为PtFLC的启动子序列。3.构建PtFLC启动子表达载体,连接报告基因,花序侵染法转化拟南芥,T0代种子播种,经抗性筛选及PCR鉴定,得到24棵阳性植株。但这些阳性植株GUS染色不成功。4.将本实验...


基于PCR的染色体步移技术研究进展

李付鹏; 伍宝朵; 马朝芝; 傅廷栋, 中国生物工程杂志 2010年12期 , 期刊

基于PCR的染色体步移技术主要用于分离已知序列侧翼的未知序列,为分离基因、步移调控区域及填补基因组测序的空隙提供极大便利。基于PCR的染色体步移技术依照原理可分成依赖连接介导PCR法和不需要酶切连接PCR法。综述了近年来以PCR为基础的染色体步移技术,比较了这些方法的原理及操作步骤,同时总结了依赖连接介导PCR法和不需要酶切连接PCR法的优点与缺点,以期对研究起到借鉴作用。...


朵丽蝶兰成花相关基因DhEFL4基因和启动子的分离与功能验证

陈韦唯, 浙江农林大学 发表时间:2014-05-30 硕士

...DNA序列,并通过转基因进行功能验证。同时利用染色体步移技术获得DhEFL4启动子序列。取得的主要研究结果如下:1、利用RACE的方法克隆到了朵丽蝶兰中DhEFL4基因的cDNA序列,其中,获得了DhEFL 基因的cDNA序列593bp bp,含有一个345 bp的ORF区,编码114个氨基酸。2、通过由处于光照进入黑暗时分朵丽蝶兰的根、茎、叶、花梗、花蕾及花器官(花瓣、萼片、唇瓣和蕊柱)进行实时定量PCR,发现花蕾的表达量最高,说明DhEFL4和朵丽蝶兰成花相关。同时分别...


猪POU1F15’侧翼启动子区域克隆、多态检测及其与生长性能的关联分析

赵芹, 扬州大学 发表时间:2009-05-01 硕士

...U1F1基因启动子区域克隆及序列分析本实验利用染色体步移技术,从长白猪基因组中首次克隆到了共约2.6kb的POU1F1基因5’侧翼区序列,结果提交Genbank(序列号:EU924264)。利用相关软件对所得结果进行了序列分析和物种间POU1F1基因5’侧翼区序列比对及进化树构建。结果表明所克隆的片段中含典型的TATA盒(-57)和类CAAT盒序列(-87)。序列比对结果表明,不同物种POU1F1基因的同源序列主要集中在转录起始点上游-150bp至-1000bp区域。转录起...


菌株Dyella ginsengisoli LA-4降解联苯及基因的克隆与表达

李昂, 大连理工大学 发表时间:2009-06-01 博士

...指纹技术对强化体系进行微生物群落动态解析;利用染色体步移法扩增得到完整的bph基因簇,并对其中的bphA1A2、bphA3、bphA4、bphB、bphC和mfphA基因进行克隆和表达。菌株LA-4是一株新的联苯降解菌,结合生理生化鉴定、菌株的形态观察、Biolog鉴定及16S rDNA序列分析,菌株LA-4归属于变形细菌Y亚类,Dyella属ginsengisoli菌种。菌株LA-4已作为专利菌种保存于中国普通微生物菌种保藏中心,注册编号为:CGMCC No.2723。菌...


染色体步移技术克隆已知序列侧翼启动子的研究进展

康丹; 方小艳; 游腾飞; 王婷婷; 眭安平; 杨星勇, 农业生物技术学报 2013年03期 , 期刊

...功能的阐释,有助于基因表达的时空控制。选择恰当方法克隆序列未知的启动子有着非常重要的意义和广阔的应用前景。随着PCR技术的问世,基于PCR扩增的染色体步移技术进行启动子克隆具有较好的可操作性,其在基因的分子生物学和基因工程研究方面也是一项重要的技术策略。本文讨论了近年来以PCR为基础的染色体步移技术克隆启动子的方法,主要包括反向PCR、接头介导PCR、半随机引物PCR三大类,归纳比较了其克隆原理和研究进展,为克隆已知序列旁侧未知启动子序列提供参考。...


芍药DELLA蛋白PlGAl1基因启动子的克隆及功能初步分析

于璐, 沈阳农业大学 发表时间:2017-06-01 硕士

...cDNA 1872 bp全长序列的基础上,利用染色体步移技术,成功克隆出芍药DELLA蛋白PlGAl1基因861 bp的启动子序列。主要的实验结果如下:1.芍药不同组织所提取DNA的质量有所不同,用Nanodrop 2000微量分光光度计对所获得的基因组DNA进行浓度、产量及PCR扩增检测,结果表明,从7种组织获得的基因组DNA中,种子、组培苗叶片、成熟叶片的OD260/OD280值在1.80-1.90之间,其中组培苗叶片所提取DNA浓度、产量最高,PCR扩增也最好;其次是...


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