avatar avatar 我的文献 Nrf2与HO-1在子痫前期发病中的作用机制研究 作者 李静 单位 山东大学 导师 王谢桐 关键词 血红素氧化酶-1; 核因子E2相关因子2; 子痫前期; 侵袭
摘要
背景:子痫前期是一种妊娠特发性疾病,目前约有4%的孕妇患有子痫前期,严重威胁孕产妇及围产儿的健康,导致多种发病率包括早产率的升高。子痫前期的高危因素包括肥胖、高龄产妇、孕妇糖尿病、种族、抗磷脂抗体综合征/易栓症、家族子痫前期病史等,其病因学一直是围产医学研究的热点,但其明确病因目前尚不清楚。近年来研究发现子痫前期的发病与氧化应激、免疫反应、炎性反应等多种病理生理反应有关,而氧化应激是众多影响因素中最重要的一项。血红素氧化酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)属于血红素氧化酶的一个亚型,是一种诱导酶,它的常见功能是在游离的亚铁血红素转变成胆红素时对限速步骤起催化作用,将血红素转变为胆绿素,胆绿素是在转换成胆红素过程最后一步中胆绿素还原酶作用的底物。血红素氧化酶有不同的生物学功能,HO-1能够调节并参与机体抗炎、抗凋亡及抗氧化应激作用,并且有助于维持孕期子宫血管的稳定性并参与孕期胎盘的形成,与子痫前期的发病关系密切。近期学者们关于HO-1在子痫前期病人血清或胎盘组织中的表达水平及作用机制等方面的研究较多,但是结果及观点并不统一。核因子 E2 相关因子 2(Nuclear factor erythroid 2-related factor-2,Nrf2)属于CNC-bZIP(cap’n’collar subfamily of basic leucine-zipper),也就是 CNC 亮氨酸拉链转录激活因子家族,可以被机体的氧化应激反应激活。早前有研究证实Nrf2在氧化应激过程中参与调节机体细胞的保护性基因,保护机体免受氧化应激的侵害,并且Nrf2在保护机体抵御致癌物质、亲电子试剂及活性氧等毒性侵害的过程中扮演重要角色。在机体多种氧化应激反应中,Nrf2可以激活机体保护基因包括HO-1基因,而在子痫前期病人的氧化应激反应中,二者是否共同参与疾病的病理生理过程并且是否存在信号通路或者关联作用,并未得到证实。我们推断Nrf2和HO-1在子痫前期的氧化应激反应中起到重要的作用。或许Nrf2作为HO-1重要的上游调节因子,在子痫前期发病的病理生理过程中也起到对HO-1的调节作用,二者作为一个信号通路参与了子痫前期的发病。子痫前期的另外一个临床特点是在治疗方面:目前没有预防和治疗子痫前期的有效措施,只有终止妊娠,胎盘娩出后,子痫前期的症状才可以得到抑制和改善,所以胎盘因素一直被当作参与子痫前期发病的重要原因。现在盛行的假设是子痫前期是由异常的滋养细胞迁移和侵入母体子宫螺旋动脉不足即胎盘浅着床导致的子宫胎盘单位血循环降低和胎盘缺血导致的。实际上,子痫前期病人与正常妊娠孕妇相比,的确子宫动脉管径更细,阻力更大。但目前胎盘滋养细胞迁移和侵袭的作用机制仍不清楚,也没有针对此方面的靶向治疗。因此,从胎盘滋养细胞侵袭能力方面入手,如果探寻到可以影响胎盘滋养细胞侵入子宫螺旋动脉的因素,除了对子痫前期病因学方面有重要意义外,对于子痫前期的靶向治疗也具有较大意义。基于上述基础,我们如果证实Nrf2作为上游因子调控HO-1参与子痫前期发病的病理生理过程,对于后续HO-1在子痫前期病人的发病及治疗中的研究将具有重要意义。若能进一步证实滋养细胞中HO-1蛋白表达水平的改变能够对滋养细胞的侵袭性造成影响,对于子痫前期病因学和靶向治疗等方面将具有重要价值。第一部分子痫前期病人胎盘组织中HO-1和Nrf2升高的协同作用目的:检测重度子痫前期病人胎盘组织中HO-1和Nrf2的表达水平差异,并且验证HO-1和Nrf2在胎盘组织中的表达是否有相关性,探讨HO-1和Nrf2在子痫前期发病中的作用,并且通过HTR-8/SVneo细胞系培养,进一步探讨Nrf2对HO-1的调控效应,验证在子痫前期发病中Nrf2是否为HO-1的上游调控因子。方法:1.共选取60例住院分娩孕妇作为研究对象,其中30例重度子痫前期患者作为研究组,30例健康足月妊娠孕妇作为对照组。2.用ELISA方法检测两组孕妇血清中HO-1蛋白的表达水平。3.采用Western blot方法检测两组孕妇胎盘组织中HO-1蛋白、Nrf2蛋白表达水平。4.用real-time PCR方法检测两组孕妇胎盘组织中HO-1 mRNA的表达水平。5.培养HTR-8/SVneo细胞系,免疫荧光定位细胞中HO-1、Nrf2蛋白的表达。6.采用 Nrf2 诱导因子 tert-butylhydroquinone(tBHQ)诱导 HTR-8/SVneo 细胞8小时后,分别检测细胞中Nrf2蛋白和HO-1 mRNA、HO-1蛋白的表达水平变化情况。结果:1.在重度子痫前期组,FGR的发生率为16.7%,其中20%的病例发生了 HELLP综合征,1例患者(3.3%)孕期发生胎儿宫内死亡。其中25例病人因重度高血压(收缩压160≥mmHg和/或舒张压>11OmmHg)接受降压治疗。另外,30例病人均接受硫酸镁解痉治疗,23例病人因为终止妊娠孕周<34进行地塞米松促胎肺成熟治疗。2.与正常妊娠组相比,重度子痫前期组血清HO-1蛋白水平明显降低(n = 30,P<0.01)。3.重度子痫前期组胎盘组织HO-1蛋白、HO-1 mRNA水平较正常妊娠组升高(n = 30,P<0.01;n = 30,P<0.05)。4.重度子痫前期组胎盘组织Nrf2蛋白的表达水平较正常妊娠孕妇增高(n =30,P<0.01)。5.采用Pearson’s相关性检验检测两组孕妇胎盘组织中HO-1蛋白和Nrf2蛋白水平的相关性,结果显示HO-1蛋白和Nrf2蛋白水平成正相关(r = 0.503,P<0.01)。采用Spearman等级相关性分析检测两组孕妇胎盘组织中Nrf2蛋白与HO-1 mRNA的相关性,同样发现Nrf2蛋白与HO-1 mRNA成正相关性(r = 0.488,P<0.01)。6.免疫荧光定位显示HTR-8/SVneo细胞核与细胞浆中均可见Nrf2蛋白表达,HO-1蛋白主要表达于HTR-8/SVneo细胞的胞浆。7.在HTR-8/SVneo细胞培养液中加入Nrf2诱导物tBHQ刺激细胞8小时后,发现细胞核中Nrf2蛋白表达量较对照细胞升高(n = 6,P<0.05)。并且接受tBHQ孵育的HTR-8/SVneo细胞中HO-1 mRNA的表达水平也较对照细胞升高(n = 6,P<0.01)。结论:1.与正常妊娠妇女相比较,重度子痫前期患者血清中HO-1水平降低。而重度子痫前期患者胎盘组织中HO-1蛋白和mRNA的表达均增高。胎盘和血清中H0-1表达水平不一致的原因可能是HO-1可以由机体多个器官合成,而妊娠期胎盘合成的HO-1并不是血清中HO-1的主要来源。2.重度子痫前期患者胎盘组织中HO-1和Nrf2水平同时增高,子痫前期孕妇可能通过胎盘组织中HO-1和Nrf2的高表达来保护子痫前期发病过程中氧化应激对机体的损伤。3.在子痫前期发病的病理生理过程中,胎盘滋养细胞中Nrf2可能作为HO-1的上游调控因子对HO-1的表达进行正向调节,激活HO-1,增加胎盘滋养细胞HO-1的表达量。第二部分HO-1对氧化应激环境下滋养细胞侵袭能力的影响目的:我们第一部分的研究提示:Nrf2在子痫前期发病中对HO-1进行正向调节,共同参与子痫前期发病的病理生理过程。而HO-1表达量的改变在氧化应激状态下是否对胎盘滋养细胞的侵袭能力造成影响,尚不明确。为进一步研究HO-1表达量的改变对胎盘滋养细胞生物学行为的影响,拟建立HTR-8/SVneo细胞氧化应激模型,然后分别抑制和诱导细胞中HO-1蛋白的表达,来探讨HTR-8/SVneo细胞在氧化应激环境下HO-1表达量的改变是否对HTR-8/SVneo细胞的侵袭能力造成影响。方法:1.培养HTR-8/SVneo细胞系,用100umol/lH202孵育12小时建立细胞氧化应激模型。2.将细胞模型分为三组:正常对照组、Znpp诱导组和Hemin诱导组,分别在三组细胞中加入相同体积的生理盐水、HO-1抑制剂Znpp和HO-1诱导剂Hemin,然后放置于37℃、5%C02的细胞培养箱中继续培养8小时备用。3.通过免疫荧光定位观察HTR-8/SVneo细胞氧化应激模型中HO-1蛋白的表达及定位。4.采用Western blot方法分别检测对照组、Znpp诱导组和Hemin诱导组HTR-8/SVneo细胞氧化应激模型中HO-1蛋白表达水平的变化。5.通过Transwell细胞侵袭实验观察在HO-1抑制剂Znpp和诱导剂Hemin作用下HTR-8/SVneo细胞氧化应激模型侵袭能力的改变。结果:1.在HTR-8/SVneo细胞系氧化应激模型中HO-1蛋白主要表达于细胞浆。2.在HO-1抑制剂Znpp的作用下,HTR-8/SVneo细胞氧化应激模型中HO-1蛋白的表达量较对照组降低(n = 6,P<0.05);在HO-1诱导剂Hemin的孵育下,HTR-8/SVneo细胞氧化应激模型中HO-1蛋白的表达量较对照组升高(n = 6,P<0.05)。3.HTR-8/SVneo细胞氧化应激模型在HO-1表达水平降低时其侵袭能力降低(n = 6,P 0.05);反之,在HO-1表达水平增高的情况下其侵袭能力有所提高(n=6,P<0.05)。结论:1.HO-1抑制剂Znpp能够有效抑制HTR-8/SVneo细胞氧化应激模型中HO-1的表达水平;同样,HO-1诱导剂Hemin能够有效诱导HTR-8/SVneo细胞氧化应激模型中HO-1的表达水平。2.在氧化应激环境中提高滋养细胞HO-1蛋白表达水平能够增加其侵袭能力,而降低HO-1蛋白表达水平则降低滋养细胞的侵袭能力,因此可尝试通过调控胎盘滋养细胞中HO-1的表达水平实现对子痫前期的靶向治疗。
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