avatar avatar 我的文献 转化生长因子β1通过Wnt/β-catenin信号通路诱导人肝癌细胞SMMC-7721上皮间质转化的实验研究 作者 王海全 单位 山东大学 导师 陈雨信 关键词 肝细胞癌; 肿瘤微环境; TGF-β1; 上皮间质转化; 侵袭及转移; 机制
摘要
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是目前我国临床上较为常见的恶性肿瘤,位于常见肿瘤的第六位及肿瘤相关性死亡原因的第三位,且近年来呈现逐渐上升的趋势。虽然随着科学技术的不断发展和外科手术技术的不断提高,目前大部分早期确诊的肝癌患者都能够实行根治性切除,但是肝癌患者的5年总体生存率仍然很低。其中最重要的因素是肝癌具有极强的侵袭和转移能力,术后5年内极易出现肿瘤复发及远处转移,很多患者在术后1-2年就会出现肝内或肝外复发、转移。所以,如何有效的控制肝癌术后复发转移是我们治疗肝癌的临床难题。肿瘤微环境包括肿瘤细胞或者间质细胞分泌的多种细胞因子、趋化因子和生长因子,它们共同组成了肿瘤细胞在体内生长、增殖、甚至是转移相关所必须的体内微环境,在肿瘤发生发展和促进肿瘤细胞侵袭转移中都发挥着关键作用。转化生长因子p1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)在肝脏等消化系统恶性肿瘤中发挥着复杂的调控作用,包括维持肿瘤干细胞的稳态,促进肝纤维化进程,作为肿瘤抑制因子参与免疫调节等。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指机体内的上皮细胞受某些体内外因素刺激后向具有间质细胞表型特征发生转变的生物学进程,目前广泛认为EMT是肿瘤侵袭转移的重要方式。细胞因子作为肿瘤微环境的一种成分,也参与了多种肿瘤的发生与发展。目前文献证明,包括TGF-β1在内的细胞因子能够以诱导肿瘤细胞发生EMT样改变的方式促进肿瘤细胞侵袭及转移。TGF-β1作为近年来的研究热点细胞因子,已被证明在肿瘤侵袭转移中起到非常重要的作用,在肝癌侵袭转移中也扮演非常重要的角色。基于上述研究背景,我们推测,肝癌微环境中细胞因子TGF-β1亦可能通过促进肝癌细胞发生EMT的方式促进肝癌细胞侵袭转移。为了验证此假说,本课题主要从以下几个方面开展研究:1.通过体外实验验证TGF-β1是否能够诱导肝癌细胞SMMC-7721发生EMT样改变,并且观察其对肝癌细胞SMMC-7721体外增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响,探讨可能的分子机制。2.针对可能的信号通路中的关键蛋白设计干扰载体siRNA处理肝癌细胞,观察其对TGF-β1诱导的肝癌细胞的形态学以及体外增殖、迁移和侵袭等生物学特性改变。3.采用、Western blot检测EMT相关蛋白及信号通路相关蛋白表达变化,探讨可能涉及的信号通路和分子机制。4.采集临床肝癌组织标本,采用免疫组织化学方法检测肝癌组织中TGF-β1蛋白、信号通路关键蛋白以及EMT相关蛋白表达情况。5.收集肝相关肝癌患者的临床病理学资料,对数据进行分析及统计学处理,获得TGF-β1与肝癌患者临床相关指标、EMT相关标志物等的相关性实验证据。本课题主要分为三个部分:第一部分TGF-β1通过诱导肝癌细胞发生EMT样改变促进肝癌细胞侵袭转移的机制研究目的观察并获得TGF-β1体外诱导肝癌细胞发生EMT样改变促进其增殖、侵袭和转移等生物学行为的实验证据。方法首先将不同浓度细胞因子TGF-β1 (5,10,20ng/mL)加入到完全培养基中与肝癌细胞SMMC-7721共培养,通过光学显微镜观察形态学变化,MTT检测肝癌细胞增殖指数的变化情况,细胞划痕实验和Transwell小室穿过实验检测TGF-β1对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响,蛋白印迹实验检测TGF-β1作用前后上皮间质转化相关标志物蛋白的表达情况。结果不同浓度细胞因子TGF-β1 (5,10,20 ng/mL)与肝癌细胞SMMC-7721分别共培养48 h后,肝癌细胞形态发生了明显变化,细胞间隙从紧密逐渐变得松散,细胞形态从立方形逐渐伸出触角并向成纤维细胞样转变,结果提示TGF-β1能够诱导肝癌细胞发生EMT样转变,并且呈现浓度依赖性。MTT结果显示:TGF-β1能够显著促进肝癌细胞SMMC-7721体外增殖,并且具有时间和剂量依赖性。细胞划痕实验和’Transwell小室穿过实验结果显示:TGF-β1能够显著增强肝癌细胞SMMC-7721体外迁移和侵袭能力。蛋白印迹实验检测上皮间质转化相关标志物蛋白表达情况,结果显示:TGF-β1作用后肝癌细胞SMMC-7721上皮细胞特征性标志物E-cadherin蛋白表达呈现下调趋势,与此同时间质细胞特征性标志物Vimentin蛋白和β-catenin蛋白表达上调,这些结果提示我们TGF-β1有可能是通过Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌细胞发生EMT样改变,从而促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为的改变。结论细胞因子TGF-β1能够通过诱导肝癌细胞发生EMT样改变的方式改变肝癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为,并且可能是通过Wnt/p-catenin信号通路发挥作用。第二部分下调表达β-catenin部分抑制TGF-β1诱导的肝癌细胞生物学特性的机制研究目的运用小干扰RNA技术下调表达β-catenin来评价Wnt/β-catenin信号通路在TGF-β1诱导肝癌细胞发生生物学行为改变中的作用。方法首先通过蛋白印迹实验验证siRNA-β-catenin的干扰效果;肝癌细胞转染对照质粒和siRNA-β-catenin后分别加入细胞因子TGF-β1进行共培养,再分别采用MTT、细胞划痕实验、Transwell实验检测肝癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的改变;蛋白印迹实验检测转染siRNA-β-catenin后加入细胞因子TGF-β1诱导的肝癌细胞中EMT相关标志物蛋白表达变化。结果siRNA-β-catenin能够显著下调肝癌细胞中P-catenin蛋白的表达;MTT结果显示:siRNA-β-catenin转染肝癌细胞后能够显著抑制TGF-β1诱导的促进肝癌细胞增殖的作用;细胞划痕实验和Transwell实验也证实转染了siRNA-β-eatenin的肝癌细胞能够部分抵抗TGF-β1诱导的促进细胞迁移和侵袭的作用;蛋白印迹实验结果显示siRNA-β-catenin转染肝癌细胞后,能够抑制TGF-β1诱导的EMT样改变,表现为EMT相关标志物蛋白的表达变化。这些结果提示我们β-catenin可能是TGF-β1诱导肝癌细胞发生EMT样改变影响其增殖、迁移、侵袭等生物学行为中的关键蛋白。结论下调肝癌细胞中β-catenin蛋白表达能够部分抑制TGF-β1诱导的EMT样改变以及相关生物学行为改变,提示β-catenin可能是TGF-β1诱导肝癌细胞发生EMT样改变中的关键蛋白分子。第三部分肝癌组织中TGF-β1高表达对肝癌预后预测的意义目的探讨临床肝癌患者组织样本中TGF-β1、β-catenin和EMT相关蛋白表达水平与临床病理学指标的相关性。方法采用免疫组织化学法检测TGF-β1、β-catenin、E-cadherin及vimentin在62例肝癌患者组织样本中的表达水平,然后将TGF-β1与肝癌患者的临床病理学资料进行相关性分析。结果TGF-β1阳性表达于肝癌细胞胞浆内,根据免疫组化结果判断标准显示:62例肝癌组织样本中48.39%(30/62)高表达TGF-β1。同时发现高表达TGF-β1肝癌组织样本中同时表现出β-catenin高表达,E-cadherin表达降低,Vimentin表达增加。相关性分析结果发现高表达TGF-pl与E-cadherin的表达呈负相关(4/30,13.33%),和β-catenin和Vimentin的表达呈正相关(29/30,96.67%;27/30,90%)(表1)。根据免疫组化评分结果我们组织样本分为高表达TGF-β1组(n=30)和低表达TGF-β1组(n=32),TGF-β1的表达情况与肝癌患者临床病理学指标的相关性结果见表2。TGF-β1的高表达与肿瘤大小(P=0.000),是否有血管侵犯(P= 0.014), AFP水平(P=0.043),肿瘤数目(P=0.008)和分化程度(P=0.007)具有显著相关性。结论肝癌组织中高表达TGF-β1伴随着β-catenin表达增加,E-cadherin表达降低,Vimentin表达增加,这些结果提示我们在体内随着TGF-含量的升高,肝癌细胞可能通过Wnt/β-catenin信号通路诱导肝癌细胞发生EMT样改变从而发生侵袭转移的潜能随之增加,TGF-β1可能成为未来临床上进行肝癌干预治疗一个新靶点。全文结论TGF-β1能够通过诱导肝癌细胞SMMC-7721发生EMT样改变的方式促进肝癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为,其机制可能是通过Wnt/β-catenin信号通路调控。临床试验进一步证明,TGF-β1在肝癌组织中高表达,且与β-catenin信号通路蛋白以及EMT标志物相关蛋白存在相关性。TGF-β1表达水平与肿瘤大小、肿瘤数目、AFP水平、分化程度以及是否有血管侵犯等肝癌临床病理指标存在明显的相关性。
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