avatar avatar 我的文献 LincRNA-p21通过抑制Notch信号诱导的EMT抑制肝癌细胞侵袭转移 作者 贾萌 单位 郑州大学 导师 薛焕洲 关键词 肝癌; 分子机制; 长链非编码RNA; ChIP; lincRNA-p21
摘要
肝癌作为恶性肿瘤疾病在临床上发病率最高。这是因为肝细胞癌恶性程度较高,发病后,病情进展快速,患者生存时间相对较短,针对肝细胞癌的治疗手段亦发展迅速,但是受到治疗手段的限制,仍有不少患者在发病5年内死亡。最近发展的分子靶向治疗因其高效性和高特异性逐渐吸引人们的注意。一种非编码RNA是转录本超过200个核苷酸长度的长链非编码RNA(lncRNA),非编码RNA以基因位置决定可以分为5种不同类型,这五类包括双向lncRNA、基因间lncRNA、基因内lncRNA、反义lncRNA、正义lncRNA。通过基因组测序分析,我们发现在人类的基因组中存在大量的长链非编码RNA,而其中有将近24000个左右从参与了多种基因相关功能,主要包括转录激活、核内运输、X染色体沉默、转录干扰、染色质修饰等多项生物学活动。通过对长链非编码RNA的研究深入开展,在多种疾病中长链非编码RNA的作用越来越明显,早期阶段microRNA的研究曾经成为热点,而长链非编码RNA在此之后再次走向研究的前沿。大量的研究指出在肿瘤的发生发展过程中长链非编码RNA的异常表达扮演了重要的角色。这是因为在早期的胚胎发育过程中长链非编码RNA参与了调节过程,因此对于肿瘤的细胞增殖特点和多发性潜能具有明显的激活作用。本文的主要重点研究涉及了长链非编码RNA在肿瘤组织中的功能和作用,有助于寻找控制肿瘤生长的长链非编码RNA。肝癌细胞长链非编码RNA相对于正常肝细胞,其表达谱变化显著,其中主要的变化趋势为上调和下调,而下调趋势更为常见。这些出现异常表达的长链非编码RNA可能涉及了多个生物学过程,其中主要包括蛋白翻译、细胞周期、mRNA剪接、基因转录等多种,表明长链非编码RNA可在蛋白质表达和表达后修饰等过程中发挥作用;同时长链非编码RNA参与了多个重要过程的信号传导调节,其中主要包括JAK-STAT、Notch、p53、MAPK等通路。我们首先通过Real-timePCR的方法分析临床样本和细胞样本,我们证实,与健康组织和正常细胞相比,LincRNA-p21在肿瘤组织中发生表达水平大幅度下调,结果暗示LincRNA-p21可能具有抑制肝癌组织生长的作用。我们通过分析肝癌肿瘤组织乙酰化组蛋白与lincrna-p21启动子的结合情况,发现肝癌组织和肝癌细胞乙酰化组蛋白h3水平对比正常肝脏组织和正常细胞,表达表达存在差异性。解释了为什么正常肝脏组织中lincrna-p21的表达水平高于肝癌组织。为了验证lincrna-p21的生物学功能,我们通过细胞转染的方法改变smmc-7721肝癌细胞内lincrna-p21的表达水平。我们构建了过表达lincrna-p21的smmc-7721细胞株,并在rna水平证明了肿瘤细胞smmc-7721转染后发生了明显的lincrna-p21表达水平增高,同时分析了notch信号蛋白hes-1和nicd的表达,结果发现与正常组织相比,表达显著下降,存在统计学意义(p<0.05)。为了进一步验证notch信号通路与emt相关蛋白表达水平之间的关系,我们通过westernblot检测emt相关蛋白e-cadherin、claudin-1、n-cadherin和snail的表达水平,于正常组织相比,表达水平明显下降。接下来我们通过sirna的方法构建lincrna-p21抑制细胞株,我们发现hepg2细胞在发生lincrna-p21抑制后notch信号通路相关蛋白hes-1和nicd的表达水平进行分析,我们发现westernblot检测notch信号蛋白hes-1和nicd的表达对比正常肝脏组织,表达显著提高。而在蛋白水平对emt相关蛋白e-cadherin、claudin-1、n-cadherin和snail的表达水平进行分析,我们发现westernblot检测emt相关蛋白e-cadherin、claudin-1、n-cadherin和snail的表达对比正常肝脏组织,表达显著提高。通过dapt作用于notch信号通路可以有效抑制肝癌细胞的侵袭迁移过程,我们发现抑制发生后notch信号蛋白hes-1和nicd的表达,结果发现与正常组织相比,表达显著下降,emt相关蛋白e-cadherin、claudin-1、n-cadherin和snail的表达出现明显下降。表明抑制notch信号通路将提高emt出现频率,可能会增强肝癌的侵袭性。而激活notch信号将取消lincrna-p21过表达对肝癌细胞侵袭转移的抑制作用。再使用jagged1处理所有实验细胞,之后采用transwell检测细胞侵袭和转移,实验结果表明肿瘤细胞的侵袭力明显提高。为了进一步明确lincrna-p21,notch通路以及emt之间的关系,我们通过抑制notch信号来观察对lincrna-p21干扰对肝癌细胞侵袭转移的促进作用的影响,结果表明抑制notch信号将取消干扰lincrna-p21对肝癌细胞侵袭转移的促进作用。然而,我们再使用dapt处理细胞后,经过transwell检测细胞侵袭和转移,我们发现抑制取消后,肿瘤细胞的侵略力明显降低。通过裸鼠肝癌模型来分析LincRNA-p21可能的机制,我们发现裸鼠感染了转染pcDNA-LincRNA-p21质粒的细胞后,体内肿瘤组织的转移情况明显降低,证明LincRNA-p21的过表达对肝脏肿瘤的侵袭和转移具有明显的抑制作用,随后证明了抑制LincRNA-p21的表达水平将有效促进肿瘤的侵袭和转移。综上所述,我们的研究加深了对肝癌转移机制的进一步理解,证明LincRNA-p21对肿瘤微环境的调控起到重要作用,是其一种新的功能。研究提示肝癌的转移过程应该重新认识,即在转移的不同阶段肝癌细胞利用不同的策略实现其恶性播散。EMT在肝癌细胞的早期侵袭过程中起着重要作用,Notch信号通路在肝癌细胞的远端定植过程中起着重要作用。证明在肝癌的侵袭-转移级联反应的早期及晚期阶段LincRNA-p21都有抑制作用,因此LincRNA-p21有潜力作为一种肝癌侵袭转移的分子靶向治疗手段及判断患者预后的基因标志,同时此研究结果对于肝癌的治疗的预防转移具有较高的临床价值。
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