avatar avatar 我的文献 IL-13在结直肠癌细胞上皮间质转化中的作用及相关机制研究 作者 曹慧 单位 浙江大学 导师 来茂德 关键词 IL-13; 结直肠癌; 上皮间质转化; IL-13Rα1; SLAT6
摘要
转移是恶性肿瘤的的主要特征之一,也是恶性肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤的转移是一个多阶段,多步骤的复杂过程。越来越多的研究证据表明上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在肿瘤的侵袭和转移过程中扮演着关键和复杂的角色。EMT是指具有上皮表型的细胞通过特定的程序转化成为具有间质表型的生物学过程。上皮细胞通过EMT过程失去细胞极性,与基底膜的连接消失,从而逐渐获得间质细胞的形态特征以及迁移侵袭能力提高和干性特征增强等生物学功能。EMT发生的分子机制非常复杂,目前仍未阐明。为了在结直肠癌(colorectal cancer, CRC)中筛选鉴定出新的调控基因,我们实验室前期对癌细胞主体和正常肠粘膜上皮细胞进行基因表达谱芯片(Affymetrix人全基因表达谱芯片GeneChip(?) Human Genome U133 Plus 2.0)检测,成功筛选出了381个差异表达基因。其中,白介素-13(interleukin-13, IL-13)在肿瘤细胞中的表达比正常细胞表达高出2.5倍。IL-13主要是由活化的Th2 (CD4+)细胞分泌的细胞因子,广泛参与器官纤维化、炎症和肿瘤的发生发展,但它在结直肠癌中的作用和机制还不是很清楚。因此,本研究旨在明确IL-13在结直肠癌细胞中的作用,并探讨相关分子机制。我们体外模拟旁分泌途径,运用人重组IL-13蛋白刺激HT29和SW480细胞后观察到这两株细胞的形态发现了明显的变化,从之前的椭圆扁平的多边形转变为松散的梭形,这表明IL-13刺激可能促进了结直肠癌细胞上皮间质转化过程的发生。然后免疫荧光结果显示IL-13处理HT29和SW480两株细胞系都能够下调上皮标志物E-cadherin的表达,其主要分布在细胞膜;而间质标记物Vimentin的表达上调,其主要分布在细胞浆。进一步分析表明,IL-13处理可在mRNA水平和蛋白水平上显著下调上皮标志物E-cadherin和ZO-1的表达,上调间质标志物MMP9和Vimentin的表达。另外,调控EMT的核心转录因子ZEB1, ZEB2和Snail的表达在IL-13诱导之后也有不同程度的增加,其中ZEB1的mRNA和蛋白水平变化最明显。IL-13还能够明显促进HT29和SW480细胞的迁移侵袭能力。由此可见,IL-13可以诱导结直肠癌细胞EMT过程的发生和促进细胞恶性衍化。为了进一步研究参与IL-13诱导EMT的具体通路,我们在IL-13刺激的HT29和SW480细胞中检测了IL-13下游的常见通路,结果显示细胞的STAT6和AKT蛋白的磷酸化水平表达显著增加,而STAT3和Erkl/2的磷酸化水平没有明显变化。运用JAK抑制剂JAK inhibitor 1 (JAKi 1)和P13K抑制剂LY294002分别抑制了IL-13处理引起的STAT6和AKT的磷酸化,其中只有JAKi 1能够有效阻断IL-13所引起的EMT标志物变化。此外,JAKi 1还可以有效逆转IL-13引起的细胞迁移和侵袭能力增强。为了进一步分析STAT6与EMT的关系,我们在HT29细胞和SW480细胞中运用shRNA干扰技术沉默STAT6的表达。结果发现STAT6干扰后的细胞在IL-13刺激前后都维持上皮样的特征,EMT标志物和ZEB1的表达不再改变,细胞迁移和侵袭能力也不再增加。以上结果表明STAT6在IL-13诱导EMT的发生过程和迁移侵袭性增强中是必须的。另外,在另一株STAT6null的结直肠癌细胞Caco2中发现,IL-13不能使该细胞系的EMT指标发生变化。然而向Caco2细胞中转入STAT6的表达载体后再用IL-13刺激即可引起EMT指标发生变化,这就再次证明IL-13引起EMT标志物表达的改变是依赖STAT6通路的激活来完成的。很多研究发现EMT过程可以使肿瘤细胞具有干细胞的特征,并且肿瘤干细胞被认为是肿瘤侵袭和转移的主要细胞,是肿瘤复发的根源。本实验结果显示IL-13可以使HT-29和SW480细胞的干性标志物nanog等的表达上调,并且可以被JAKi 1逆转。在STAT6干扰的HT29和SW480细胞株中IL-13也不能诱导干性标志物的表达增加。这说明IL-13可以引起干细胞标志表达的上调,并且也同样是受STAT6通路调控的。随后,我们在实验室所有的结直肠癌细胞株中检测了IL-13的受体IL-13Rα1和IL-13Rα2 mRNA水平的表达。结果表明,IL-13Rα2除了在RKO细胞株中高表达外,在其它的细胞株中都呈现低表达或者不表达,而IL-13Rα1在所有的细胞株中都高表达。然后我们在33例结直肠癌患者的肿瘤组织和配对正常组织cDNA中对IL-13Rα1和IL-13Rα2进行mRNA水平上的表达检测。结果显示IL-13Rα1在肿瘤组织中的表达明显高于其配对的正常组织,而IL-13Rα2在所有样本中表达都偏低,且肿瘤和正常组织之间表达没有差异。同时,我们发现前面细胞实验用到的HT29和SW480细胞只表达IL-13Rα1,并且JAK/STAT6通路是IL-13Rα1受体介导的主要通路,这也就可以揭示IL-13主要通过IL-13Rα1受体激活STAT6通路促进EMT的发生和细胞恶性衍化。此外,我们发现TGF-β和TNF-α诱导的EMT模型可以使IL-13Rα1表达上调,而对IL-13Rα2没有影响,这就暗示了IL-13和其它的经典EMT诱导因子可能协同参与结直肠癌EMT的发生,具体机制还需要进一步研究。综上,本研究揭示了IL-13/IL-13Rα1/STAT6通路在结直肠癌细胞中可以促进EMT的发生和细胞迁移侵袭能力及干性特征的增加,并藉此提供了新的潜在结直肠癌转移相关生物标志物和治疗药物分子靶点。
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