avatar avatar 我的文献 长链非编码RNA LINC01133在结直肠癌转移中的作用 作者 孔建鲁 单位 浙江大学 导师 来茂德 关键词 长链非编码RNA; 结直肠癌; 上皮间质转化; 转移; SRSF6
摘要
结直肠癌是世界上最常见的威胁人类健康的恶性肿瘤之一。在所有的恶性肿瘤中,结直肠癌每年的发病率和死亡率都高居前列。在最近几年,全世界每年都有超过60万患者死于结直肠癌。超过90%的肿瘤患者死亡是由肿瘤转移引起的。近年来的研究显示:恶性肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)是恶性肿瘤发生转移的重要机制。EMT是指细胞在内部因素和外界环境的综合作用下由上皮细胞表型转变成间质细胞的过程。通过发生上皮间质转化,上皮来源的恶性肿瘤细胞获得间质细胞表型,获得了侵袭和转移的能力。那么恶性肿瘤发生EMT的分子机制又是什么呢?之前的大多数研究都是集中在对蛋白质分子的研究上。然而蛋白质分子所对应的mRNA在人类转录组中只占不到20%,超过80%的转录组是不能翻译成蛋白质的。这部分转录组对应的RNA就是非编码RNA(noncoding RNA, ncRNA)。这其中大部分是长度超过200个核苷酸的长链非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNA), lncRNA在转录组中占据了绝大部分,它们必将会发挥着不可替代的功能,否则数目众多的lncRNA对细胞就会是一种负担,与进化过程中生命对使用物质和能量节约原则相悖。所以lncRNA在调控结直肠癌发生上皮间质转化过程中也很可能发挥着重要作用。我们选用TGF-p刺激结直肠癌细胞来构建诱导EMT发生的模型。然后将TGF-p处理的结直肠癌细胞作为实验组,将未处理的结直肠癌细胞作为对照组。为了鉴定出参与结直肠癌发生上皮间质转化过程中的lncRNA,我们对两组细胞做了转录组微矩阵芯片分析。从中鉴定出了差异表达的长lncRNA LINC01133。 LINC01133在TGF-β诱导EMT过程中表达显著下调。于是我们选择LINC01133作为研究对象来研究其在结直肠癌EMT和转移中的作用,并得出了以下结论:一、LINC01133的表达受到TGF-β的抑制。得到芯片结果之后,我们重复了TGF-β刺激构建结直肠癌细胞EMT模型试验。并通过q-RTPCR对芯片结果做了验证,证明LINC01133的表水平确实能被TGF-β下调。并且当阻断TGF-β受体或者通过沉默TGF-β通路下游的smad2后,LINC01133的表达水平又能恢复。结果表明LINC01133是受TGF-β抑制的一条长链非编码RNA。二、LINC01133抑制结直肠癌细胞EMT和转移。为了研究长链非编码RNA LINC01133在结直肠癌细胞发生EMT和转移中的作用。我们使用小干扰RNA在高表达LINC01133的结直肠癌细胞中的敲低LINC01133表达水平,在低表达LINC01133的结直肠癌细胞HCT116中过表达LINC01133。当LINC01133被敲低后,结直肠癌细胞的迁移侵袭能力增强,上皮标志物E-cadherin表达水平下调,间质标志物Fibronectin、Twist表达上调;LINC01133过表达后,结直肠癌细胞的迁移侵袭能力减弱,上皮标志物E-cadherin表达水平上调,间质标志物Fibronectin表达下调。同时小鼠尾静脉注射肺转移模型显示,LINC01133敲低后结直肠癌细胞的转移能力增强。同时结直肠癌临床样本研究表明LINC01133在肿瘤组织中表达明显下调,肿瘤组织中LINC01133表达水平高的患者远处转移率低,生存预后好,并且肿瘤组织中LINC01133表达水平与E-cadherin呈正相关,与Vimentin呈负相关。以上结果表明LINC01133可以抑制结直肠癌发生EMT和转移。三、LINC01133与SRSF6相结合并且可能通过阻断SRSF6促EMT的作用来抑制结直肠癌EMT和转移(1)鉴定LINC01133的结合蛋白SRSF6。我们通过改良ChIRP实验结合质谱鉴定出LINC01133的结合蛋白SRSF6.并通过Western Blot实验用SRSF6的抗体进行了验证。此外,又通过RIP反向验证SRSF6蛋白对LINC01133的结合作用。经过正反两方面的验证,我们确认长链非编码RNA LINC01133 和 SRSF6 蛋白有相互作用。(2)SRSF6促进结直肠癌细胞发生EMT和转移。在鉴定出LINC01133的结合蛋白SRSF6之后,我们又验证了SRSF6对结直肠癌的EMT和转移的调控作用。我们在高表达LINC01133的HT29细胞系、低表达LINC01133的HCT116细胞系和不表达LINC01133 的 SW620细胞系中利用慢病毒介导的shRNA将S RSF6干扰敲低。我们发现当SRSF6表达水平敲低以后,结直肠细胞的迁移侵袭能力减弱,上皮标志物E-cadherin表达水平上调,间质标志物Fibronectin、Twist表达下调;LINC01133过表达后,结直肠细胞的迁移侵袭能力减弱,上皮标志物E-cadherin表达水平表达上调,间质标志物Vimentin、 Fibronectin等表达下调。以上结果表明SRSF6可以不依赖于LINC01133,单独地促进结直肠癌细胞EMT和转移。(3)LINC01133对结直肠癌细胞EMT和转移的抑制用依赖于SRSF6我们通过实验验证LINC01133对结直肠癌细胞EMT过程的调控作用是否依赖于SRSF6.当SRSF6的表达被敲低后,LINC01133对EMT相关的蛋白标志物的调控以及对结直肠癌细胞迁移能力的调控作用都减弱了。结果提示我们长链非编码RNALINC01133对结直肠癌发生EMT和转移的抑制作用依赖于其与SRSF6结合和对SRSF6促EMT功能的阻断。综合以上结果可以得出结论:长链非编码RNA LINC01133通过与SRSF6相互作用来抑制结直肠癌EMT和转移。
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