avatar avatar 我的文献 肌细胞增强因子MEF2D在结直肠癌侵袭转移中的作用和分子机制研究 作者 苏立 单位 第三军医大学 导师 钱程 关键词 结直肠癌; MEF2D; 上皮间质转化; 肿瘤转移; 肿瘤微环境
摘要
全世界范围内结直肠癌都是最常见的恶性肿瘤之一,也是危及人类健康的重大疾病。近年来我国结直肠癌的发病率和死亡率逐渐上升,结直肠癌的防治问题日益重要。结直肠癌有高转移的肿瘤生物学特性,临床上转移性结直肠癌患者占到肠癌总患者的40%以上,其预后极差,现有治疗手段大多只能延长患者生存而无法治愈,所以结直肠癌的转移是其防治中的重点和难点。但关于肠癌转移的机制认识还很不足,没有明确的转移预测分子标志,也没有很好的治疗靶点,所以研究结直肠癌的转移机制有重大意义。通常认为肿瘤细胞的上皮间质样转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤转移步骤中重要的一环,但肠癌EMT的过程中有些问题目前认识得还远远不够。比如经典的EMT转录因子在肠癌细胞中是如何被调控的,诱导肿瘤发生EMT的微环境信号又是通过哪些分子来激活癌细胞中的EMT关键基因的。对这些问题的探讨有助于深入认识肠癌EMT的机制,从而为转移性肠癌的防治发现潜在的分子靶点。MEF2(Myocyte Enhancer Factor 2)家族是具有多种生物学功能的转录因子家族,其在胚胎发育,器官形成,肌肉,心血管和神经系统中的重要作用已早被人们所认识。近年来MEF2家族成员在肿瘤的作用也逐渐被发现。我们课题组之前发现MEF2家族第4号成员即MEF2D在肝癌中异常高表达,其促进肝癌细胞增殖并导致预后不良。后续有其他课题组报道了MEF2D在肺癌和骨肉瘤中的促癌作用,提示MEF2D可能是某些实体瘤中的潜在“癌基因”,但MEF2D在结直肠癌中作用尚无报道,而且之前MEF2D在癌症中的研究主要局限于其对癌细胞增殖的作用,MEF2D是否具有其他促肿瘤功能目前也不明确。基于上述研究背景,我们在结直肠癌中展开了MEF2D促肿瘤功能的研究,致力于探讨MEF2D对结直肠癌侵袭转移的作用及其机制。本课题的主要研究内容及结果如下:1.检测临床结直肠癌组织中MEF2D的表达情况,并探讨MEF2D表达与肿瘤的临床病理特征和患者预后的关系以免疫组化的方法在93例临床结直肠癌标本中探讨了mef2d的表达情况。结果发现mef2d在结直肠癌组织中较相邻癌旁组织和对应正常肠粘膜组织有显著异常的高表达,提示mef2d可能在结直肠癌的发生发展中起着某些作用。通过比较不同临床病理特征的患者肿瘤中mef2d表达的差异,我们发现mef2d的异常高表达与结直肠癌的淋巴结转移、远处转移以及复发具有正相关性,而与患者的生存时间呈负相关,这些结果初步提示了mef2d可能促进肿瘤转移,并导致不良预后。2.在细胞实验和动物肿瘤模型中研究了mef2d对肠癌细胞侵袭转移能力的影响在高侵袭且间质样的癌细胞与低侵袭且上皮样的癌细胞之间比较mef2d的表达,我们发现mef2d表达量与细胞的侵袭能力正相关,而与上皮样标志物e-cadherin表达负相关。通过敲低mef2d和过表达mef2d,我们证明了mef2d具有促进肠癌细胞迁移和侵袭转移的功能,并在动物实验中验证了mef2d对肠癌细胞在小鼠体内转移的重要作用。3.研究mef2d对肠癌细胞emt表型的影响通过在mef2d高表达的间质样肠癌细胞中敲低其表达,同时在低mef2d表达的上皮样肠癌细胞中过表达mef2d,我们发现mef2d对肿瘤细胞的emt表型确有调控作用:它在间质样细胞中维持其间质样表型,并促进上皮样细胞发生emt。4.发现mef2d调控emt的关键分子zeb1,并探讨其调控的具体分子机制通过敲低mef2d观察其对部分emt关键分子表达的影响,结果发现多种细胞中zeb1的表达均明显下降。通过mef2d过表达实验,免疫荧光,流式细胞术等进一步检测mef2d与zeb1的表达的关系,证明了emt关键转录因子之一的zeb1的表达受到mef2d的调控。通过染色质免疫沉淀,启动子报告基因检测等方法实验证明了zeb1是mef2d直接靶基因。另外我们发现敲低mef2d后zeb1启动子组蛋白乙酰化水平减低,组蛋白乙酰化酶p300在zeb1启动子上的结合下降。5.在微环境emt诱导因子的诱导下观察mef2d的表达及其功能以常用的肠癌细胞emt诱导因子如egf和缺氧,构建肠癌细胞的emt模型,并观察其中mef2d的变化。实验结果发现mef2d在多种微环境emt诱导信号刺激下表达都明显且迅速地上调,敲低mef2d后部分因子诱导的细胞emt过程受到明显的阻碍。6.探讨MEF2D在微环境EMT诱导因子激活ZEB1表达中的作用通过观察MEF2D和ZEB1在胞外EMT信号刺激下表达的动态变化,我们推测MEF2D的表达上调可能是ZEB1表达激活的前提。在MEF2D稳定敲低的细胞中以多种EMT诱导因子来刺激细胞,发现其ZEB1的表达激活被阻断。并且我们在实验小鼠转移瘤标本中观察到,在MEF2D敲低细胞接种产生的转移肿瘤中ZEB1的表达不能检出。综上所述,本研究得出的主要结论有:1.MEF2D在人类结直肠癌中异常高表达且与转移和预后不良相关;2.MEF2D在肠癌细胞侵袭转移和EMT中起重要调控作用;3.MEF2D能够直接转录调控EMT的关键转录因子ZEB1;4.MEF2D能在多种微环境EMT诱导因素的刺激下迅速显著上调表达,并在这些EMT过程中起必要作用;5.MEF2D能够汇集多种微环境的EMT诱导信号,是这些微环境信号激活EMT关键分子的重要节点。
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