avatar avatar 我的文献 MALAT1-AKAP9-CIP4分子信号轴调节结直肠癌的增殖、侵袭和转移 作者 胡志燕 单位 南方医科大学 导师 李祖国 关键词 MALAT1; AKAP9; CIP4; 结直肠癌; 增殖; 转移
摘要
研究背景和目的结直肠癌是胃肠道恶性肿瘤中常见的恶性肿瘤之一,其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。结直肠癌的发生率在我国有明显上升趋势。近些年以来,虽随着诊疗新技术的应用和化疗药物的不断更新,结直肠癌患者的预后得到了极大的改善,但患者总生存率并没有得到显著提高,其主要原因是大多数结直肠癌患者在行根治性手术之前已出现了体内转移。肿瘤的转移是导致恶性肿瘤患者死亡的重要原因,肿瘤转移是一个复杂的过程,了解复杂的肿瘤浸润和转移过程中的关键分子机制,有助于开展结直肠癌有效治疗方法的研究。随着分子生物学技术的不断发展,肿瘤的病因及发病机制研究已获得重要的进展,但是对肿瘤的转移研究并未取得实质性的突破。侧重和加强肿瘤的转移机制基础研究,阐明肿瘤的转移分子机制,是肿瘤研究的较前沿课题,对提高恶性肿瘤治愈率和患者的生存率具有重要的科学意义。随着人类基因组计划的顺利完成,其基因组中非编码RNA在人类生命发生发展过程中起着重要作用。非编码RNA可能行成了其特殊且未被人类完全认识的RNA调控分子信息网络,调节着高级生物真核细胞的遗传物质的表达,以及基因转录和后转录、细胞分化和个体发育、遗传和表观遗传等几乎所有的重要生命活动中发挥着重要作用。我们课题组前期研究证实长链非编码RNA基因MALAT1 (metastasis associated lung adenocarcinoma transcriptl)在结直肠癌组织中的表达明显上调,通过靶向调控其靶基因AKAP9的表达促进结直肠癌细胞体外的增殖、迁移和侵袭。AKAP9基因的表达在结直肠癌组织中明显上调,且与结直肠癌的浸润深度和转移密切相关。但是,AKAP9是否与结直肠癌的增殖、侵袭和转移相关,具体通过怎样的分子途径促进结直肠癌的转移,这些研究国内外还未见相关文献报道。非编码RNA MALAT1调控AKAP9的分子机制以及AKAP9基因的生物学功能和其调控结直肠癌转移的分子机制都还不清楚。CIP4 (Cdc42-interacting protein 4)是由TRIP10基因编码的蛋白。在细胞内吞过程中,CIP4在协调细胞质膜微管转化以及肌动蛋白细胞骨架重组过程中起着重要的作用:CIP4能与脂质如磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸和磷脂酰丝氨酸相结合并促进膜内陷和微管的形成;并且,CIP4是细胞伪足形成和特异单核细胞来源的肌动蛋白丰富的粘附结构所必须的。许多研究表明,CIP4蛋白在许多肿瘤中异常表达,CIP4蛋白能促进乳腺癌、肺腺癌、成骨肉瘤等肿瘤的增殖、侵袭和转移。另外,CIP4蛋白与细胞发生EMT (epithelial-mesenchymal transition)现象密切相关。有研究发现,CIP4可与AKAP350 (AKAP9基因的可变剪接亚型)在高尔基体发生相互作用。在肾近端小管上皮细胞中CIP4能促进TGF-β1诱导的EMT;此外,敲低CIP4表达后明显加强细胞连接联合处的管状上皮型囊泡的形成。我们猜想AKAP9可能与CIP4相互作用并调控其表达,进一步诱发结直肠癌细胞发生EMT,从而促进结直肠癌的侵袭和转移。综上所述,我们推测MALAT1-AKAP9-CIP4分子信号轴可能参与调控结直肠癌的增殖、侵袭和转移。但是,目前尚未有文献报道MALAT1是如何调控其靶基因AKAP9的表达以及AKAP9-CIP4相关信号在结直肠增殖、侵袭和转移中的作用。因此,本研究旨在探讨MALAT1-AKAP9-CIP4分子信号轴如何调节结直肠癌的增殖、侵袭和转移,为探讨结直肠癌生长、转移机理提供可靠的实验依据。研究方法1.结直肠癌细胞中MALAT1调控AKAP9表达的相关分子机制研究(1)利用RNA-IP、免疫共沉淀(Co-IP)和免疫荧光共定位技术,验证MALAT1与剪接因子SRSF1蛋白和SRPK1蛋白发生相互作用。(2)利用Western blotting和荧光定量RT-PCR检测Scranmble-SW48、 RNAa-MALAT1-SW480和RNAi-MALAT1-SW480细胞中SRSF1蛋白的表达情况;利用Western blotting、免疫荧光、细胞核浆分离技术检测Scranmble-SW480、 RNAa-MALAT1-SW480和RNAi-MALAT1-SW480细胞中磷酸化的SRSF1蛋白的表达以及细胞亚定位情况。(3)利用Western blotting、荧光定量RT-PCR和免疫荧光检测Scranmble-SW48、RNAa-MALAT1-SW480和RNAi-MALAT1-SW480细胞中SRPK1蛋白的表达;利用SRPK1蛋白活性抑制剂SRPIN340按浓度梯度处理RNAa-MALAT1-SW480细胞之后,采用Western blotting技术,检测处理后RNAa-MALAT1-SW480细胞中SRPK1、AKAP9、磷酸化SRSF1蛋白的表达改变情况。(4)利用Western blotting和细胞核浆分离技术, 检测RNAi-MALAT1-SW480细胞中过表达SRPK1蛋白后SRPK1 AKAP9和磷酸化SRSF1蛋白的表达改变;利用CCK8细胞增殖实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验,检测RNAi-MALAT1-S W480细胞中过表达SRPK1蛋白后对体外结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。(5)利用Western blotting和细胞核浆分离技术,检测RNAa-MALAT1-S W480细胞中干扰SRPK1蛋白后SRPK1、AKAP9和磷酸化SRSF1蛋白的表达改变;利用CCK8细胞增殖实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验,检测RNAa-MALAT1-SW480细胞中干扰SRPK1蛋白对体外结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。2.探讨AKAP9对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响(1)利用慢病毒包装系统,制备稳定干扰AKAP9的病毒上清,将其转导至Lovo和HT29细胞中,建立稳定干扰AKAP9的Lovo和HT29细胞亚系。(2)利用CCK8细胞增殖试验、平板克隆形成试验、划痕试验、Transwell迁移以及侵袭试验,观察干扰AKAP9表达后结直肠癌细胞体外增殖、克隆形成能力、迁移以及侵袭能力的改变。(3)采用裸鼠皮下瘤试验以及裸鼠鼠尾静脉转移模型实验观察干扰AKAP9表达后结直肠癌细胞体内的成瘤和转移能力的改变。3.证实AKAP9在结直肠癌细胞中与CIP4相互作用并且调控CIP4表达(1)利用免疫共沉淀(Co-IP)和免疫荧光共定位的方法观察结直肠癌细胞中AKAP9蛋白与CIP4蛋白之间的相互作用。(2)利用Western b lotting、荧光定量RT-PCR和免疫荧光检测稳定干扰AKAP9表达的Lovo和HT29细胞亚系中CIP4的表达情况。4.验证CIP4在结直肠癌细胞株及组织中的表达(1)采用Western blotting检测了CIP4在人正常结直肠粘膜细胞FHC以及HT29、Lovo、M5、SW620、SW480、LS174T、HCT116和DLD18种结直肠癌细胞株中的表达。(2)采用免疫组化方法检测了38例结直肠癌标本组织及其配对的正常组织中CIP4和AKAP9的表达。5.分析AKAP9-CIP4对结直肠癌细胞EMT的影响(1)利用Western blotting和免疫荧光检测稳定干扰AKAP9表达的Lovo和HT29细胞亚系中EMT相关标志物蛋白(E-cadherin、 N-cadherin、 Vimentin)的表达。(2)利用Western blotting检测干扰Lovo和HT29细胞中CIP4的表达之后,细胞中CIP4、E-cadherin、 N-cadheri、 Vimentin的表达改变;检测过表达Lovo和HT29细胞中CIP4的表达之后,细胞中CIP4、E-cadherin、 N-cadherin、 Vimentin的表达改变。(3)利用TGF-β1以5ng/ml浓度刺激Lovo和HT29细胞48小时后,采用Western blotting检测细胞中AKAP9、CIP4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达改变。(4)利用Western blotting技术,通过检测细胞株中AKAP9、CIP4、 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达改变,验证在结直肠癌Lovo和HT29细胞中AKAP9是TGF-β1诱导细胞发生EMT所必须的,并且CIP4可回复AKAP9的功能。6.探讨AKAP9-CIP4对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响利用CCK8细胞增殖实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验,在稳定干扰AKAP9表达的Lovo和HT29细胞亚型中回复CIP4表达,检测体外结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的改变。7.统计学分析采用SPSS 16.0软件进行数据的统计分析。细胞中荧光定量RT-PCR结果比较2-△△Ct值,三组以上比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齐时用Welch近似方差分析;方差齐性的多重比较用LSD法、SNK(Student-Newman-Keuls)法,方差不齐时用Dunnett’s T3法。两组比较采用两独立样本t检验(Independent-Samples t test),方差不齐时采用近似t检验。平板克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验结果用单因素方差分析(One-Way ANOVA)和独立样本t检验(Independent-Samples t test)。CCK8体外增殖实验采用析因设计的方差分析和单因素方差分析。组织中CIP4和AKAP9表达量的相关性,正态分布资料选用Pearson相关系数,非正态分布资料选用Spearman相关系数;P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1. MALAT1通过调控SRPK1介导SRSF1蛋白磷酸化水平调节AKAP9的表达以及结直肠癌细胞的生物学功能(1)MALAT1、SRPK1和SRSF1,两两之间存在相互作用RNA-IP实验的RT-PCR实验验证结果显示:SW480-SRPK1-IP和SW480-SRSF1-IP实验组中有扩增出MALAT1表达的条带,表明已检测到与SRPK1和SRSF1蛋白相结合的MALAT1的表达;SW480-SRPK1-IP和SW480-SRSF1-IP实验组中MALAT1与SRPK1和SRSF1蛋白结合的mRNA灰度值明显高于其相应阴性对照组;荧光定量RT-PCR检测结果显示:SW480-SRPK1-IP和SW480-SRSF1-IP实验组中的MALAT1与SRPK1和SRSF1蛋白相结合的mRNA明显高于其相应处理组中的阴性对照(P<0.05,P<0.001);Co-IP实验结果显示:在结直肠癌细胞SW480中,SRSK1蛋白与SRSF1蛋白存在相互作用。以上实验结果表明:在SW480细胞中,MALAT1、SRPK1和SRSF1,两两之间存在相互作用。(2) MALAT1促进结直肠癌细胞核中的磷酸化SRSF1蛋白表达Western blotting和荧光定量RT-PCR检测结果显示:SRSF1的表达在Scranmble-SW48、RNAa-MALAT1-SW480和RNAi-MALAT1-SW480细胞中表达不具有统计学差异(F=2.373,P>0.05;F=0.335,P>0.05)。然而,通过细胞核浆分离技术,利用Western blotting检测Scranmble-SW480、 RNAa-MALAT1-SW480和RNAi-MALAT1-SW480细胞细胞核中磷酸化SRSF1的表达,发现以Scranmble-SW480作为对照,磷酸化SRSF1在RNAa-MALAT1-S W480细胞细胞核中的表达明显高于对照组(F=71960,P<0.001),而在RNAi-MALAT1-SW480细胞细胞核中的表达明显低于对照组(F=71960,P<0.001)。免疫荧光结果显示:磷酸化的SRSF1蛋白主要富集于细胞核中,并且激活MALAT1可促进磷酸化SRSF1蛋白的表达,相反地,干扰MALAT1之后可抑制磷酸胡SRSF1蛋白的表达。因此,MALAT1不影响结直肠癌细胞SRSF1蛋白表达,但是MALAT1可正向调控结直肠癌细胞细胞核中磷酸化SRSF1的表达水平。(3)MALAT1调控结直肠癌细胞中SRPK1蛋白的表达,并且抑制SRPK1蛋白活性之后可抑制磷酸化SRSF1和AKAP9蛋白的表达Western blotting和荧光定量RT-PCR检测结果显示:SRPK1的表达在Scranmble-SW48、RNAa-MALAT1-SW480和RNAi-MALAT1-SW480细胞中表达存在差异,并具有统计学意义(F=18.561,P<0.01;F=226.34,P<0.001)。以Scranmble-SW480作为对照,SRPK1在RNAa-MALAT1-SW480细胞中的表达明显高于对照组,而在RNAi-MALAT1-SW480细胞中的表达明显低于对照组。免疫荧光实验得到相似的实验结果。因此,MALAT1可正向调控结直肠癌细胞中SRPK1的表达水平。我们采用SRPK1特异性抑制剂SRPIN340按浓度梯度(0uM、10uM、40uM、50uM)处理RNAa-MALAT1-SW480细胞48小时之后提取蛋白,Western blotting检测SRPIN340不同浓度处理后RNAa-MALAT1-SW480细胞中SRPK1、 AKAP9、磷酸化SRSF1蛋白的表达。与空白处理组和0.02%DMSO处理组相比,SRPIN340处理之后,SRPK1的蛋白表达未发生明显变化(F=0.120,P>0.05),而磷酸化的SRSF1和AKAP9蛋白的表达下调(F=0.658.307,P<0.001;F=59.675,P<0.001),并且存在抑制剂SRPIN340浓度依赖现象。因此,实验结果显示,SRPIN340处理RNAa-MALAT1-SW480细胞后抑制了SRPK1的活性,不影响SRPK1蛋白表达;SRPIN340处理RNAa-MALAT1-SW480细胞后抑制了磷酸化SRSF1和AKAP9蛋白的表达。(4)RNAi-MALAT1-SW480细胞中回复SRPK1表达后,可通过回复磷酸化SRSF1蛋白的表达回复AKAP9蛋白表达和细胞功能成功构建过表达SRPK1蛋白质粒后,将该质粒及其对照质粒转染至RNAi-MALAT1-SW480细胞中后,采用Western blotting检测细胞中SRPK1、 AKAP9和磷酸化SRSF1蛋白的表达,实验结果显示:与Scramble-SW480组相比,RNAi-MALAT1/Vector-SW480组中SRPK1、AKAP9和磷酸化SRSF1蛋白的表达明显下调(F=184.199,P<0.001;F=852.730,P<0.001);与RNAi-MALAT1/Vector-SW480组相比,RNAi-MALAT1/SRPK1-S W480组细胞中成功过表达SRPK1蛋白后,AKAP9和磷酸化SRSF1蛋白的表达水平得以回复(F=184.199,P<0.001;F=852.730,P<0.001)。采用细胞核浆分离技术和Western blotting检测Scramble-SW480、 RNAi-MALAT1/Vector-SW480和RNAi-MALAT1/SRPK1-S W480细胞中细胞核与细胞浆中磷酸化SRSF1的表达情况。结果显示在细胞浆中未检测到明显的磷酸化SRSF1蛋白表达,磷酸化SRSF1蛋白表达主要位于细胞核中:与Scramble-SW480细胞核蛋白组相比,RNAi-MALAT1/Vector-SW480细胞核蛋白组中磷酸化SRSF1蛋白的表达明显下调(F=473.610,P<0.001);与RNAi-MALAT1/Vector-SW480细胞核蛋白组相比,RNAi-MALAT1/SRPK 1-S W480细胞核蛋白组中磷酸化SRSF1蛋白的表达水平得以回复(F=473.610,P<0.001)。细胞核中得以回复表达的磷酸化SRSF1蛋白促进了AKAP9前体mRNA的有效剪接,故在RNAi-MALAT1-SW480细胞回复SRPK1蛋白表达之后,AKAP9的表达同时也得到了回复。利用CCK8细胞增殖实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验,检测Scramble-SW48、RNAi-MALAT1/Vector-SW480和RNAi-MALAT1/SRPK1-SW480细胞的增殖、迁移和侵袭能力。CCK8细胞增殖实验结果表明:与Scramble-SW480细胞组相比,RNAi-MALAT1/Vector-SW480细胞组细胞的增殖能力下降(F=155.933,P<0.001);然而,在RNAi-MALAT1-SW480细胞中回复SRPK1表达之后,与RNAi-MALAT1/Vector-SW480细胞组相比,RNAi-MALAT1/SRPK1-SW480细胞的增殖能力得到回复(F=155.933,P<0.001)。细胞划痕实验transwell迁移实验结果表明:与Scramble-SW480细胞组相比,RNAi-MALAT1/Vector-SW480细胞的迁移能力明显下调(F=2645,P<0.001;F=2020,P<0.001);然而,在RNAi-MALAT1-SW480细胞中回复SRPK1表达之后,与RNAi-MALAT1/Vector-SW480细胞组相比,RNAi-MALAT1/SRPK 1-SW480细胞的迁移能力明显得到回复(F=2645,P<0.001;F=2020,P<0.001)。Transwell侵袭实验结果表明:与Scramble-SW480细胞组相比,RNAi-MALAT1/Vector-SW480细胞的侵袭能力明显下调(F=612.122,P<0.001);然而,在RNAi-MALAT1-SW480细胞中回复SRPK1表达之后,与RNAi-MALAT1/Vector-SW480细胞组相比,RNAi-MALAT1/SRPK1-SW480细胞的侵袭能力明显得到回复(F=612.122,P<0.001)。(5)RNAa-MALAT1-SW480细胞中干扰SRPK1后,可通过抑制磷酸化SRSF1蛋白的表达抑制AKAP9蛋白表达以及细胞生物学功能利用siRNAs干扰片段干扰RNAa-MALAT1-SW480细胞中SRPK1的表达之后,采用Western blotting检测细胞中SRPK1、AKAP9和磷酸化SRSF1蛋白的表达,实验结果显示:与Scramble-SW480组相比,RNAa-MALAT1/siCtrl-SW480组中SRPK1、AKAP9和磷酸化SRSF1蛋白的表达明显上调(F=804.517,P<0.001;F=4417,P<0.001);然而,与RNAa-MALAT1/siCtrl-SW480组相比, RNAa-MALAT1/siSRPK1-1-SW480和RNAa-MALAT1/siSRPK1-2-S W480组中细胞成功干扰SRPK1蛋白的表达后,AKAP9和磷酸化SRSF1蛋白的表达水平下调(F=804.517,P<0.001;F=4417,P<0.001)。采用细胞核浆分离技术和Western blotting检测Scramble-SW480、RNAa-MALAT1/siCtrl-SW480、RNAa-MALAT1/siSRPK1-1-SW480和RNAa-MALAT1/ siSRPK1-2-SW480细胞中细胞核与细胞浆中磷酸化SRSF1的表达情况。结果显示在细胞浆中未检测到明显的磷酸化SRSF1蛋白表达,磷酸化SRSF1蛋白表达主要位于细胞核中;与Scramble-SW480细胞核蛋白组相比,RNAa-MALAT1/ siCtrl-SW480细胞核蛋白组中磷酸化SRSF1蛋白的表达明显上调(F=286.811,P<0.001);与RNAa-MALAT1/siCtrl-SW480细胞核蛋白组相比,RNAa-MALAT1 /siSRPK1-1-SW480和RNAa-MALAT1/siSRPK1-2-SW480细胞核蛋白组中磷酸化SRSF1蛋白的表达水平下调(F=286.811,P<0.001)。细胞核中减少磷酸化SRSF1蛋白表达减少了对AKAP9前体mRNA的有效剪接,故在RNAa-MAL AT1-SW480细胞干扰SRPK1蛋白表达之后,AKAP9的表达同时受到抑制。利用CCK8细胞增殖实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验,检测Scramble-SW480, RNAa-MALAT1/siCtrl-SW48、RNAa-MALAT1/siSRPK1-1-SW480和RNAa-MALAT1/siSRPK1-2-SW480细胞的增殖、迁移和侵袭能力。CCK8细胞增殖实验结果表明:与Scramble-SW480细胞组相比,RNAa-MALAT1/siCtrl-SW480细胞组细胞的增殖能力增强(F=381.239,P<0.001);然而,在RNAa-MALAT 1-S W480细胞中干扰SRPK1表达之后,与RNAa-MALAT1/siCtrl-SW480细胞组相比,RNAa-MALAT1/siSRPK1-1-SW480和RNAa-MALAT1/siSRPK1-2-SW480细胞的增殖能力明显受到抑制(F=381.239,P<0.001)。细胞划痕实验和Transwell迁移实验结果表明:与Scramble-SW480细胞组相比,RNAa-MALAT1/siCtrl-SW480细胞组细胞的迁移能力明显增强(F=200.39,P<0.001;F=128.877,P<0.001);然而,在RNAa-MALAT1-S W480细胞中干扰SRPK1表达之后,与RNAa-MALAT1/siCtrl-SW480细胞组相比,RNAa-MALAT1/siSRPK1-1-S W480和RNAa-MALAT1/siSRPK1-2-SW480细胞的迁移能力明显受到抑制(F=200.39,P<0.001;F=128.877,P<0.001;F=396.765,P<0.001)。Transwell侵袭实验结果表明:与Scramble-SW480细胞组相比,RNAa-MALAT1/siCtrl-SW480细胞组细胞的侵袭能力明显增强(F=396.765,P<0.001);然而,在RNAa-MALAT1-SW480细胞中干扰SRPK1表达之后,与RNAa-MALAT1/siCtrl-SW480细胞组相比,RNAa-MALAT1/siSRPK1-1-S W480和RNAa-MALAT1/siSRPK1-2-SW480细胞的侵袭能力明显受到抑制(F=396.765,P<0.001)。以上实验结果表明,在RNAa-MALAT1-SW480细胞中干扰SRPK1蛋白表达后,可抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力。以上结果表明,MALAT1调控AKAP9的表达是通过调控SRPK1介导的磷酸化SRSF1蛋白的表达水平,从而调节结直肠癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力。2. AKAP9促进结直肠癌细胞体内外的生长和转移(1)成功构建稳定干扰AKAP9基因的细胞亚系Lovo/shAKAP9和HT29/shAKAP9,其相应对照组Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl。荧光定量RT-PCR和Western bloting检测结果表明,与对照Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl相比,AKAP9在Lovo/shAKAP9和HT29/shAKAP9细胞中mRNA和蛋白水平表达明显下降(F=13.446,P<0.01,F=9.529,P<0.05;F=8.46,P<0.01,F=2.723,P<0.05)(2)CCK-8细胞增殖实验表明:与对照Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl相比,干扰AKAP9表达后抑制Lovo和HT29细胞的增殖(P<0.01:P<0.001)。平板克隆形成试验也得到相似的结果(P<0.01;P<0.001)。(3)划痕实验表明:与对照Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl相比,干扰AKAP9之后,Lovo和HT29细胞的迁移愈合能力下降(P<0.001;P<0.05)。Transwell迁移实验表明:与对照Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl相比,干扰AKAP9之后,Lovo和HT29细胞的迁移能力下降(P<0.001:P<0.001)。Transwell侵袭实验表明:与对照Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl相比,干扰AKAP9之后,Lovo和HT29细胞侵袭能力下降(P<0.001:P<0.001)(4)裸鼠皮下瘤试验表明:与对照Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl相比,Lovo/shAKAP9和HT29/shAKAP9组皮下肿瘤生长速度明显减慢,皮下瘤体积缩小(P<0.001;P<0.001)。皮下瘤免疫组化染色表明,Lovo/shAKAP9和HT29/shAKAP9组皮下瘤组织中靶基因AKAP9和增殖指数Ki-67表达下调(P<0.01,P<0.01:P<0.01,P<0.01)。(5)裸鼠鼠尾静脉转移模型实验显示:与对照Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl相比,Lovo/shAKAP9和HT29/shAKAP9组中均未发现小鼠肺转移,而对照Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl组中各有5/6和4/6的小鼠发生肺转移,在其他脏器中均未发现转移结节。统计结果显示对照组与实验组之间肺转移小鼠数目有明显差异(P=0.003;P=0.014)。因此,AKAP9促进结直肠癌细胞体内外的增殖、侵袭和转移。3. AKAP9在结直肠癌细胞中与CIP4相互作用并且调控CIP4表达(1)免疫共沉淀(Co-IP)实验结果显示:在结直肠癌细胞Lovo和HT29细胞中,AKAP9蛋白能与CIP4蛋白发生特异性结合,两者之间存在相互作用:同样,免疫荧光共定位实验结果发现在结直肠癌Lovo和HT29细胞中AKAP9蛋白与CIP4蛋白存在着共定位现象。(2)Western blotting和荧光定量RT-PCR实验结果表明:与对照Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl相比,Lovo-shAKAP9和HT29-shAKAP9细胞组中AKAP9和CIP4的蛋白(F=3.829,P<0.01,F=2.84,P<0.001; F=7.248,P<0.001,F=6.285,P<0.01)和mRNA表达水平明显下降(F=5.170,P<0.001,F=13.077,P<0.01;F=8.780,P<0.01,F=13.914,P<0.01)。免疫荧光实验也得到相似的实验结果。以上结果表明,在结直肠癌细胞Lovo和HT29细胞中,AKAP9与CIP4相互作用,并且AKAP9调控CIP4的表达。4.CIP4在结直肠癌细胞株和结直肠癌组织中表达上调(1)利用Western blotting检测CIP4在结直肠癌细胞HT29、Lovo、M5、SW620、SW480、LS174T、HCT116和DLD1以及人正常结肠细胞FHC中的表达情况。CIP4在结直肠癌细胞和人正常结直肠粘膜FHC细胞中的表达存在差异(F=4741,P<0.001),Dunnett ’s T3多重比较结果显示CIP4在结直肠癌细胞中的表达均高于其在人正常结直肠粘膜细胞FHC中的表达,并且CIP4在大多数结直肠癌细胞中的表达与AKAP9在结直肠癌细胞中的表达一致。(2)免疫组化结果显示:检测的38例结直肠癌组织标本及其配对正常组织CIP4和AKAP9的表达,30例配对结直肠癌组织中CIP4和AKAP9在癌组织中的表达明显高于其配对正常组织;CIP4和AKAP9在38例癌组织的平均表达水平明显高于其在38例配对的正常组织中的平均表达水平(P<0.05;P<0.05);而且,CIP4和AKAP9的表达在38例结直肠癌组织标本中存在正向相关关系(r=0.337;P=0.038)。5. AKAP9-CIP4参与TGF-β1诱导结直肠癌细胞发生EMT(1) Western blotting和免疫荧光检测稳定干扰AKAP9表达的Lovo/shAKAP9和HT29/shAKAP9细胞中EMT相关标志物蛋白:E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达。实验结果表明:与对照Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl相比,EMT上皮标志物E-cadherin在Lovo/shAKAP9和HT29/shAKAP9细胞中的表达明显上调(F=2.571,P<0.001;F=0.348,P<0.01),EMT间质标志物N-cadherin和Vimentin在Lovo/shAKAP9和HT29/shAKAP9细胞中的表达明显下调(F=4.121,P<0.01,F=3.118,P<0.01;F=2.671,P<0.001,F=5.984,P<0.05);免疫荧光实验也得到相似的实验结果。(2)采用siRNA片段干扰Lovo和HT29细胞中CIP4的表达之后,Western blotting检测细胞中CIP4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达;Western blotting实验结果表明:与Lovo/siCtrl和HT29/siCtrl对照组相比,有效干扰Lovo和HT29细胞中CIP4的表达之后,EMT间质标志物N-cadherin和Vimentin表达明显下调(F=455.855,P<0.001,F=6572,P<0.001;F=892.652,P<0.001;F=276.189,P<0.001),EMT上皮标志物E-cadherin的表达明显上调(F=3658,P<0.001:F=155.015,P<0.001);通过转染表达CIP4质粒过表达Lovo和HT29细胞中CIP4的表达之后,Western blotting检测细胞中CIP4、E-cadherin、 N-cadherin、Vimentin的表达;Western blotting实验结果表明:与Lovo/Vector和HT29/Vector对照组相比,有效过表达Lovo和HT29细胞中CIP4的表达之后,EMT间质标志物N-cadherin和Vimentin表达明显上调(F=0.175,P<0.001,F=4.377,P<0.001;F=6.472,P<0.01;F=0.022,P<0.001),EMT上皮标志物E-cadherin的表达明显下调(F=7.654,P<0.01;F=3.519,P<0.001)。(3)利用TGF-β1以5ng/ml浓度刺激Lovo和HT29裸细胞48小时后,提取蛋白。Western blotting实验结果显示:与Lovo/Control和HT29/Control对照组相比,用TGF-β1刺激Lovo和HT29裸细胞后,细胞中AKAP9和CIP4的表达明显上调(F=4.565,P<0.01,F=10.799,P<0.05;F=4.37,P<0.001,F=6.397,P<0.05),EMT间质标志物N-cadherin表达明显上调(F=0.506,P<0.05;F=0.032,P<0.001);EMT上皮标志物E-cadherin的表达明显下调(F=9.616,P<0.01;F=13.085,P<0.01)。(4)Western blotting实验结果显示:与裸细胞Lovo和HT29组相比,TGF-β1诱导后促进细胞AKAP9和CIP4的表达,并且促发细胞发生EMT;与TGF-β1+shCtr处理Lovo和HT29组相比,TGF-β1+shAKAP9处理Lovo和HT29组中AKAP9和CIP4表达下调,同时细胞EMT受到抑制;与TGF-β1+shAKAP9处理Lovo和HT29组相比,TGF-β1+shAKAP9+CIP4处理Lovo和HT29组中成功回复CIP4的表达之后,细胞EMT得以回复(F=846.921,P<0.001,F=151.105,P<0.001;F=1746,P<0.001,F=627.425,P<0.001;F=297.01 1,P<0.001,F=7027,P<0.001;F=289.121,P<0.001,F=397.951,P<0.001;F=330.430,P<0.001,F=278700,P<0.001)。以上结果表明,AKAP9-CIP4参与TGF-β1诱导结直肠癌细胞发生EMT。6. AKAP9通过CIP4促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭(1)CCK-8细胞增殖实验表明:与对照Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl相比,干扰AKAP9表达后抑制Lovo和HT29细胞的增殖,而共表达shAKAP9/CIP4之后Lovo和HT29细胞的体外增殖能力得到回复(P<0.001,P<0.001)。(2)划痕实验表明:与对照Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl相比,干扰AKAP9表达后抑制Lovo和HT29细胞迁移愈合能力,而共表达shAKAP9/CIP4之后Lovo和HT29细胞的迁移愈合能力得到回复(P<0.01,P<0.001);Transwell迁移实验表明:与对照Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl相比,干扰AKAP9之后,Lovo和HT29细胞的迁移能力下降,而共表达shAKAP9/CIP4之后Lovo和HT29细胞的迁移愈合能力得到回复(P<0.001,P<0.001)。(3) Transwell侵袭实验表明:与对照Lovo/shCtrl和HT29/shCtrl相比,干扰AKAP9之后,Lovo和HT29细胞的侵袭能力下降,而共表达shAKAP9/CIP4之后Lovo和HT29细胞的侵袭能力得到回复(P<0.001,P<0.001)。以上结果表明,AKAP9通过靶向调控CIP4,从而调控结直肠癌细胞发生EMT,进而调控结直肠癌细胞的侵袭与转移能力。结论1. MALAT1是通过调控SRPK1介导的SRSF1磷酸化蛋白表达水平调控AKAP9的表达,从而调节结直肠癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力。2. AKAP9促进结直肠癌细胞体内外的增殖、侵袭和转移。3.在结直肠癌细胞中,AKAP9与CIP4存在相互作用,并且AKAP9可靶向调控CIP4的表达。4.CIP4在结直肠癌细胞株和结直肠癌组织中表达上调,并且CIP4与AKAP9在结直肠癌细胞株和结直肠癌组织中的表达呈正相关。5. AKAP9-CIP4参与TGF-β1信号通路诱导结直肠癌细胞发生EMT。6. AKAP9通过CIP4促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。
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