avatar avatar 我的文献 核糖体蛋白S5抑制肝癌细胞间质转化和肿瘤干细胞产生 作者 齐阳 单位 第二军医大学 导师 张俊平 关键词 核糖体蛋白S5; 肝细胞癌; 上皮细胞间质转化; 肝癌干细胞; 苦参碱衍生物
摘要
研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝脏最常见的恶性肿瘤之一。乙肝和丙肝病毒感染,黄曲霉素B1暴露和肝纤维化是肝细胞癌发生发展的主要危险因素。目前手术切除、肝脏移植、放化疗等是常用的治疗手段,但是大部分肝癌患者术后仍会出现全身性转移和复发,因而愈后情况并不乐观。越来越多的研究报道,肝细胞癌的转移与上皮细胞间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)密切相关。EMT是指上皮细胞丢失细胞极性变成可移动的间充质细胞的过程。在各种刺激因子作用下,肝细胞癌细胞发生EMT过程可获得对化疗药的抵抗、迁移侵袭能力增强和干性等特征。转化生长因子-β(transforming growth factorβ,TGFβ)作为一种多功能细胞因子,可激活细胞内多条信号通路参与EMT过程,是一个最强的EMT诱导剂。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)或肿瘤起始细胞(tumor initiating cells,TIC)是指肿瘤细胞中具有干细胞特征且能够发展为异质性肿瘤的一小部分细胞。肿瘤干细胞可通过自我更新和分化产生大量肿瘤细胞,具有放化疗抵抗,同时在体内具有很高的成瘤性。有研究表明,EMT与细胞获得干细胞特征密切相关。例如,Twist、Snail高表达或TGFβ刺激可诱导人乳腺上皮细胞发生EMT,获得CD44high/CD24low乳腺癌干细胞。类似地,乳腺癌干细胞也可由CD8+T细胞诱导乳腺癌上皮细胞发生EMT过程获得。核糖体蛋白表达异常与多种肿瘤有关。核糖体蛋白S5(ribosomal protein S5,RPS5)参与构成真核生物核糖体40S小亚基,主要与细胞内蛋白质合成相关。研究发现RPS5在肝癌中高表达,在结肠癌中低表达。近年来发现RPS5还有核糖体外功能。例如,RPS5能抑制鼠红白血病(murine erythroleukemia,MEL)细胞分化。课题组前期研究发现,RPS5能抑制肝星状细胞活化和EMT进程以及实验性肝纤维化,这些作用与其降低AKT在Ser473和Thr308位点的磷酸化,以及降低下游蛋白分子GSK3β和P70S6K的磷酸化密切相关。此外,还发现RPS5是苦参碱衍生物MASM的靶点。MASM通过稳定肝星状细胞和实验动物模型肝脏内RPS5蛋白表达,发挥抗肝纤维化作用。目前关于RPS5与肝癌细胞EMT过程和肿瘤干细胞产生之间的研究,国内外均未见报道。研究目的本课题将探讨RPS5与肝癌细胞EMT过程和肿瘤干细胞产生的关系。此外,鉴于RPS5作为MASM的靶蛋白,我们还将研究MASM对肝肿瘤干细胞产生的作用。通过以上研究,阐明RPS5与肝癌之间的关系,进一步明确RPS5参与调控的相关分子机制,探讨RPS5作为肝癌治疗潜在新靶点的可能性。研究方法一、RPS5在肝癌细胞EMT中的作用1、RPS5在TGFβ1诱导肝癌细胞发生EMT过程中表达变化以TGFβ1诱导肝癌细胞Huh7和HCCLM3 EMT为模型,观察不同浓度的TGFβ1刺激Huh7和HCCLM3细胞不同时间后肝癌细胞的形态改变,并抽提细胞蛋白和总RNA。用Western blots和Real time PCR分别检测EMT相关指标(ZO-1、E-cadherin、N-cadherin和vimentin)及RPS5在蛋白和m RNA水平的表达变化。2、RPS5敲减对肝癌细胞EMT的影响(1)Huh7细胞分别转染RPS5的三个小干扰序列和对照Control si RNA,72 h后抽提细胞蛋白和总RNA。Real time PCR和Western blots检测三个小干扰序列的干扰效果,并考察RPS5敲减后对EMT标志物E-cadherin和vimentin蛋白表达的影响。(2)构建表达shRPS5和对照sh NC载体,包装成Lenti-sh NC和Lenti-shRPS5慢病毒。慢病毒感染Huh7细胞72 h后,细胞加或不加TGFβ1再处理48 h,抽提细胞RNA和蛋白。Real time PCR和Western blots检测EMT相关指标和RPS5的表达变化。部分实验将Huh7细胞接种于细胞爬片上,感染Lenti-sh NC和Lenti-shRPS5慢病毒。用免疫细胞荧光方法检测细胞中EMT标志物蛋白表达水平的变化。3、RPS5表达下调诱导EMT的作用机制研究Huh7细胞用2.5 ng/ml TGFβ1刺激48 h和72 h后,或感染Lenti-shRPS5和Lenti-sh NC 72 h后,加或不加TGFβ1处理48 h,抽提细胞蛋白。Western blots检测PI3K/AKT/GSK3β,ERK和Smad2通路蛋白。4、RPS5过表达对RPS5 shRNA促进的EMT进程的影响构建过表达RPS5载体(该RPS5序列转录的RPS5m RNA不能被RPS5shRNA所识别,称之为RPS5突变体RPS5-mutant)和对照GFP载体,包装成Lenti-GFP和Lenti-RPS5-mutant慢病毒。Huh7细胞感染Lenti-sh NC和Lenti-shRPS5慢病毒24 h后,再感染Lenti-GFP和Lenti-RPS5-mutant慢病毒。继续培养96h后抽提细胞蛋白。Western blots检测RPS5及EMT标志物(E-cadherin和vimentin)蛋白,同时检测EMT相关信号通路蛋白。5、RPS5过表达对肝癌细胞迁移能力的影响构建过表达RPS5载体(该RPS5基因序列与人源的RPS5基因序列一致),包装Lenti-RPS5慢病毒和对照Lenti-GFP慢病毒。Huh7和HCCLM3用TGFβ1刺激不同时间,或感染Lenti-GFP和Lenti-RPS5慢病毒72 h后,Transwell迁移实验评价肝癌细胞的迁移能力。二、RPS5在肝肿瘤干细胞产生中的作用1、RPS5过表达对肝肿瘤干细胞样细胞产生的影响(1)Huh7细胞感染Lenti-GFP和Lenti-RPS5慢病毒并用嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系Huh7-GFP和Huh7-RPS5。Western blots方法确证稳转细胞系中RPS5蛋白高表达,流式细胞仪检测RPS5对Ep CAM+和CD133+细胞数目的影响。(2)Huh7-GFP和Huh7-RPS5细胞悬浮培养于干细胞培养基中,7天后计数第1代球体细胞个数并拍照比较球体大小。将第1代球体细胞继续培养7天后计数第2代球体细胞个数。(3)瞬时感染Lenti-GFP和Lenti-RPS5慢病毒5天的Huh7细胞或Huh7-GFP和Huh7-RPS5稳转细胞,抽提细胞RNA。Real time PCR方法检测干性相关基因(Ep CAM,CD133,Sox2,Oct3/4)的表达。(4)不同浓度梯度的多柔比星(Doxorubicin,DOX)处理Huh7-GFP和Huh7-RPS5稳转细胞72 h后,CCK8方法检测细胞增殖情况,评价细胞对DOX的敏感性。2、8个肝癌细胞系RPS5表达水平的比较培养人正常肝细胞系LO2和8个人肝癌细胞系MHCC-97H、MHCC-97L、Hep3B、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Hep G2、HCCLM3和Huh7,抽提细胞蛋白。Western blots检测不同细胞株RPS5蛋白表达水平。3、比较不同RPS5表达水平的肝癌细胞系其肿瘤干细胞特征选择RPS5相对高表达细胞LM3和相对低表达细胞Huh7进行以下实验:(1)流式细胞仪检测LM3和Huh7细胞中Ep CAM+和CD133+细胞数目。(2)用干细胞培养基培养LM3和Huh7细胞7天后,拍照观察球体细胞大小并计数球体细胞个数。(3)Real time PCR方法检测LM3和Huh7细胞中干性相关基因(Ep CAM,CD133,Sox2,Oct3/4)表达。(4)用不同浓度梯度的DOX和5-氟尿嘧啶(5-FU)处理LM3和Huh7细胞72 h后,CCK8方法检测细胞增殖情况。三、苦参碱衍生物MASM在肝肿瘤干细胞产生中的作用1、MASM体外对肝肿瘤干细胞的作用(1)MASM(0,2,10和20μM)处理Huh7和Hep3B球体细胞72 h后,流式细胞仪检测球体细胞中Ep CAM+和CD133+细胞数及凋亡细胞数。Real time PCR检测球体细胞中干性相关基因(CD133,Ep CAM,Sox2和Oct3/4)和肝细胞相关基因(ALB,CYP1A3和G-6-P)表达变化。(2)用上述不同浓度的MASM处理Huh7和Hep3B球体细胞7天后,拍照观察第1代球体细胞大小并计数球体个数。将各组第1代球体细胞在无药条件下再培养7天后计数第2代球体个数。依此法,培养获得第3代球体细胞并计数。2、MASM对体内肝癌种植瘤的生长及肝肿瘤干细胞生成的影响将人的肝癌细胞Huh7接种于裸鼠皮下构建异种移植瘤模型。细胞接种24h后给予药物处理。药物处理分组:(1)生理盐水组;(2)MASM处理组(10 mg/kg,每天灌胃给药);(3)DOX组(6 mg/kg,腹腔注射,每周一次);(4)DOX和MASM联合给药组。给药处理21天。待皮下种植瘤长出后,测量并计算肿瘤体积大小。实验结束后手术剥离皮下种植瘤拍照并称重。取MASM处理组和生理盐水组肿瘤组织,经胰酶消化后获得单细胞悬液,在干细胞培养基中培养观察肿瘤干细胞成球能力的差异。Real time PCR检测MASM处理组和生理盐水组肿瘤组织中干性相关基因以及肝细胞相关基因表达的差异。3、MASM作用机制研究(1)MASM(0,2,10和20μM)处理Hep3B和Huh7细胞72 h后,抽提细胞蛋白。Western blots检测PI3K/AKT/m TOR/P70S6K和GSK3β/β-catenin信号通路蛋白。(2)用10μM的CHIR-99021(GSK3β特异性抑制剂)与10μM MASM单独或联合处理Hep3B和Huh7细胞72 h后,抽提细胞蛋白。Western blots检测GSK3β/β-catenin信号通路蛋白的表达变化。结果一、RPS5在肝癌细胞EMT中的作用(一)RPS5在TGFβ1诱导肝癌细胞发生EMT过程中表达下调TGFβ1处理Huh7细胞48 h或72 h后,细胞由典型的卵圆形上皮细胞形态变为长梭形间质细胞形态。Western blots和Real time PCR结果表明,TGFβ1处理后可显著下调上皮细胞标志物E-cadherin,而上调间质细胞标志物N-cadherin和vimentin(p<0.01),同时RPS5 m RNA和蛋白表达水平显著下调(p<0.01)。TGFβ1处理LM3细胞第5天开始LM3细胞呈现长梭形间质细胞形态,同时上调vimentin m RNA和蛋白表达水平,下调E-cadherin和RPS5(p<0.01)。提示RPS5在EMT中可能发挥重要的作用。(二)RPS5敲减促进肝癌细胞EMT1、RPS5 si RNA促进Huh7肝癌细胞发生EMTRPS5 si RNA转染细胞72 h后,RPS5 si RNA3可显著下调RPS5 m RNA和蛋白水平,同时减少E-cadherin表达(p<0.05),而增加N-cadherin和vimentin表达(p<0.01),表明单独的RPS5表达下调即可诱导肝癌细胞发生EMT。2、RPS5 shRNA慢病毒感染细胞敲减RPS5促进EMT进程与RPS5 si RNA作用相似,RPS5shRNA慢病毒感染细胞后可显著减少RPS5m RNA和蛋白表达(p<0.01),同时显著下调E-cadherin m RNA和蛋白表达(p<0.05),上调vimentin表达(p<0.05)。免疫细胞荧光结果表明,RPS5敲减后的细胞中E-cadherin表达明显下调,而vimentin表达明显上调。并且RPS5的作用不依赖于TGFβ1。(三)RPS5表达下调诱导EMT的作用机制1、TGFβ1刺激诱导EMT过程激活的细胞信号通路TGFβ1处理Huh7细胞诱导EMT发生,激活了AKT,ERK和Smad2信号通路,显著增加AKT,ERK和Smad2磷酸化水平。这与文献报道结果是一致的。2、RPS5 shRNA慢病毒感染细胞敲减RPS5促进EMT的作用机制RPS5敲减后激活了AKT,ERK和Smad2信号通路,增加了AKT,ERK和Smad2磷酸化水平。(四)RPS5过表达逆转RPS5 shRNA促进的EMT进程和相关信号通路1、RPS5过表达逆转RPS5 shRNA促进的EMT进程在RPS5敲减的细胞中感染Lenti-RPS5-mutant慢病毒后,RPS5表达水平显著增加(p<0.05),同时下调的E-cadherin表达和上调的vimentin表达被部分恢复。表明RPS5可抑制EMT过程。2、RPS5过表达逆转RPS5 shRNA激活的AKT和ERK通路在RPS5敲减的细胞中感染RPS5过表达突变体慢病毒Lenti-RPS5-mutant后,可明显降低RPS5敲减后升高的AKT(Ser473)及其下游m TOR(Ser2448)磷酸化水平以及ERK(Thr202/Tyr204)磷酸化水平,而对升高的Smad2(Ser465/467)磷酸化无显著影响。提示RPS5通过抑制AKT和ERK通路阻止EMT进程。(五)RPS5过表达抑制肝癌细胞迁移能力Transwell迁移实验结果显示,TGFβ1处理Huh7或LM3细胞后细胞迁移数明显多于对照组。这与文献报道结果是一致的。RPS5过表达细胞迁移数明显少于对照组。表明RPS5过表达抑制肝癌细胞迁移能力。这可能与RPS5抑制EMT过程有关。二、RPS5在肝肿瘤干细胞产生中的作用(一)RPS5过表达抑制肝肿瘤干细胞样细胞的产生1、Huh7细胞RPS5过表达抑制肝肿瘤干细胞样细胞的产生Western blots结果确证Huh7-RPS5稳转细胞系中RPS5明显高表达。与对照Huh7-GFP细胞相比,RPS5过表达的Huh7细胞中CD133+干细胞的数目明显减少(83.76%vs.70.90%,p<0.05),而对Ep CAM+细胞数无显著影响(98.77%vs.96.51%)。2、RPS5过表达抑制Huh7成球能力和自我更新能力细胞悬浮成球培养实验显示,Huh7-RPS5细胞系产生的球体个数显著少于Huh7-GFP细胞系(99�8 vs.70�4个,p<0.05),表明RPS5过表达抑制Huh7细胞成球能力。第二代球体细胞计数发现,Huh7-RPS5细胞系的球体个数依然少于Huh7-GFP细胞系(50�2 vs.38�3个,p<0.05)。表明RPS5过表达抑制Huh7细胞自我更新能力。3、Huh7细胞RPS5过表达抑制干性相关基因的表达Huh7细胞瞬时转染RPS5过表达慢病毒5天后可显著降低干性相关基因Ep CAM,Sox2和Oct3/4 m RNA水平(p<0.05),但对CD133无影响。RPS5稳转细胞系Huh7-RPS5中Ep CAM和CD133在m RNA水平的表达显著下降(p<0.05),而Sox2和Oct3/4表达无明显变化。4、RPS5过表达对DOX的耐药性降低耐药性实验结果表明,RPS5过表达可略微增加Huh7细胞对DOX的敏感性。DOX对Huh7-GFP细胞的IC50值为0.34μM,而对Huh7-RPS5细胞的IC50值为0.23μM。(二)8个肝癌细胞系RPS5表达水平的比较Western blots结果表明,LM3,PLC/PRF/5和Hep G2细胞中RPS5表达水平相对较高,而Huh7,SMMC-7721,Hep3B,MHCC-97H和MHCC-97L细胞中RPS5表达水平相对较低,与正常肝细胞系LO2表达水平相当。(三)比较不同RPS5表达水平的肝癌细胞系的肿瘤干细胞特征1、Ep CAM+/CD133+肝肿瘤干细胞数比较流式细胞仪检测结果表明,RPS5相对高表达LM3细胞中CD133+细胞数明显少于Huh7细胞(7.33%vs.81.11%,p<0.01),而Ep CAM+细胞数两者无显著差异(89.46%vs.96.26%)。2、肝癌细胞成球能力的比较RPS5相对高表达LM3细胞球体个数明显少于RPS5相对低表达Huh7细胞个数(62�2个和104�4个,p<0.05)。3、干性相关基因表达水平的比较Real time PCR结果表明,RPS5相对高表达LM3细胞中Ep CAM和CD133在m RNA水平表达显著低于RPS5相对低表达Huh7细胞(p<0.01),而Sox2和Oct3/4表达水平无显著差异。4、耐药性比较RPS5相对高表达细胞株LM3对DOX的敏感性较RPS5低表达Huh7细胞高(IC50值:0.12μM vs.0.90μM,p<0.05);LM3对5-FU的敏感性较Huh7相对较高(IC50值:76.5μM vs.454.5μM,p<0.05)。三、苦参碱衍生物MASM抑制肝肿瘤干细胞产生(一)MASM体外抑制肝肿瘤干细胞1、MASM减少球体细胞Ep CAM+/CD133+细胞数目流式细胞仪检测结果显示,MASM(10μM和20μM)处理Hep3B和Huh7球体细胞72 h可显著减少两种球体细胞Ep CAM+/CD133+的细胞数目,Hep3B球体细胞中Ep CAM+/CD133+的细胞数目由对照组的97.0%分别降低为86.5%和76.5%,Huh7球体细胞中Ep CAM+/CD133+的细胞数目由对照组的94.1%分别降低为82.1%和73.4%。2、MASM对球体细胞凋亡的影响MASM(10μM和20μM)处理Hep3B和Huh7球体细胞72 h可以不同程度的诱导球体细胞的凋亡,Hep3B球体细胞的凋亡率由对照组15.4%增加到21.1%和27.4%,Huh7球体细胞的凋亡率由对照组10.4%增加到13.5%和17.8%。3、MASM抑制肝癌球体细胞生长和自我更新(1)MASM(10μM和20μM)与Hep3B和Huh7球体细胞共孵育7天可以显著减少第1代球体细胞数目和球体大小,表明MASM能抑制肝癌球体细胞的生长。(2)将第1代球体细胞消化后在无药情况下,继续培养第2代和第3代球体细胞。结果显示药物处理组球体细胞个数依然少于对照组,提示MASM抑制肝癌球体细胞的自我更新。4、MASM诱导肝肿瘤干细胞向肝细胞分化MASM处理Hep3B和Huh7球体细胞72 h,可浓度依赖性地降低干性相关基因(Ep CAM,CD133,Sox2和Oct3/4)的表达水平(p<0.05),而显著增加肝细胞相关基因(ALB,CYP1A3和G-6-P)的表达水平(p<0.05),提示MASM诱导肝肿瘤干细胞向肝细胞分化。(二)MASM抑制体内肝癌细胞异种移植瘤的生长及肝癌干细胞生成1、MASM抑制体内肝癌种植瘤的生长体内实验结果表明,MASM(10 mg/kg)连续灌胃给药21天可以显著抑制Huh7细胞异种移植瘤的生长。MASM对肿瘤生长的抑制作用与DOX作用相当,二者合用后效果更佳。实验结束后剥离肿瘤拍照并称重,瘤块大小和重量的结果与前述的肿瘤生长曲线结果一致。表明MASM可以抑制体内异种移植瘤的生长。2、MASM抑制体内肝肿瘤干细胞成球能力瘤块组织消化分散为单细胞,再用干细胞培养基培养7天,结果显示MASM处理组的球体个数显著少于对照组的球体个数(26�5 vs.75�7,p<0.05)。这与体外结果是一致的。3、MASM促进瘤块组织中肿瘤干细胞向肝细胞的分化Real time PCR结果表明,MASM处理组瘤块组织中干性相关基因(Ep CAM,CD133,Sox2和Oct3/4)的表达水平显著低于对照组(p<0.05),而肝细胞相关基因(ALB,CYP1A3和G-6-P)的表达水平显著高于对照组(p<0.05)。这与体外结果是一致的。(三)MASM抑制肿瘤干细胞的分子机制1、MASM抑制PI3K/AKT信号通路不同浓度的MASM处理Huh7和Hep3B 72 h后,Western blots结果表明,MASM可以剂量依赖性的抑制PI3K/AKT相关信号通路蛋白的表达,降低PI3K,AKT,m TOR和P70S6K磷酸化水平。2、MASM抑制β-catenin信号通路由于GSK3β是AKT的下游分子,而且GSK3β可以磷酸化β-catenin(Ser33/Ser37/Thr41)导致其进一步的降解,但GSK3β不能磷酸化β-catenin(Ser675)。因此,我们检测MASM对GSK3β和β-catenin磷酸化的影响以及β-catenin及其下游蛋白Cyclin D1的表达水平。结果发现,MASM处理Huh7和Hep3B 72h后,可以显著降低GSK3β(Ser9)磷酸化水平,同时促进β-catenin(Ser33/Ser37/Thr41)磷酸化,但对β-catenin(Ser675)磷酸化无影响。并且MASM下调β-catenin和Cyclin D1的蛋白表达水平。进一步应用GSK3β特异性抑制剂CHIR验证MASM是否特异地抑制β-catenin信号通路。结果显示:与MASM作用相反,GSK3β特异性抑制剂CHIR可增加GSK3β(Ser9)磷酸化水平,抑制β-catenin(Ser33/Ser37/Thr41)磷酸化而不影响β-catenin(Ser675)磷酸化,并且上调β-catenin蛋白水平。与MASM单独作用相比,MASM与CHIR合用时,β-catenin(Ser33/Ser37/Thr41)磷酸化水平则较低,伴随较高的β-catenin蛋白水平。这些结果提示MASM降低肝癌细胞内β-catenin水平可能是通过激活GSK3β,因为GSK3β(Ser9)磷酸化会导致其活性抑制,进而稳定β-catenin。结论1、TGFβ1刺激肝癌细胞发生EMT过程中,伴随RPS5表达下调。2、RPS5表达水平降低可促进肝癌细胞EMT,其作用机制是通过激活AKT和 ERK通路。3、RPS5过表达能抑制肝癌细胞迁移和肝癌干细胞样细胞产生。4、MASM抗肝癌作用与其抑制肝癌干细胞的自我更新及诱导其向肝细胞分化 有关,这些作用可能是通过抑制肝癌细胞PI3K/AKT/m TOR通路和 GSK3β/β-catenin信号通路实现的。
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