avatar avatar 我的文献 Prrx1基因在胰腺癌EMT中的作用及机制研究 作者 邹晨 单位 南京医科大学 导师 苗毅 关键词 胰腺癌; 转移; 上皮间质转化(EMT); 配对相关同源框1
摘要
目的胰腺癌是一种恶性程度高、易早期转移、预后极差的消化系统肿瘤。深入研究胰腺癌的浸润和转移机制,对于控制其进展,改善预后具有重要意义。慢性胰腺炎是胰腺癌发生的危险因素,有研究表明上皮间质转化(EMT)与慢性炎症疾病及肿瘤发生发展密切相关。研究发现,配对相关源框1(paired related homeobox 1, Prrx1)基因在肺癌、结肠癌和甲状腺癌中多种实体瘤中高表达,且其高表达与癌细胞侵袭转移正相关。但该基因在胰腺癌中研究甚少,分子机制尚不清楚。本研究旨在通过临床组织水平和离体细胞水平的研究,阐明Prrx1基因在胰腺癌发生发展中的作用及分子机制,为临床探索胰腺癌基因治疗的分子靶点提供新的思路。方法(一)临床研究:收集胰腺癌、慢性胰腺炎以及正常胰腺组织标本,应用免疫组织化学法分别检Prrx1和EMT相关分子E-cadherin、Vimentin蛋白表达情况,分析不同组织中Prrx1、E-cadherin、Vimentin阳性表达率的差异,并分别分析Prrx1阳性表达率及E-cadherin、Vimentin阳性表达率与胰腺癌病理学特征之间的关系,进一步探讨Prrx1阳性表达率与E-cadherin、Vimentin阳性表达率之间是否具有相关性;(二)细胞学研究(1)培养人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7和3株胰腺癌细胞(AsPC-1、BxPC-3和CFPAC-1),采用Western Blot方法检测Prrx1蛋白在细胞株中表达情况;(2)根据Prrx1基因mRNA特点,设计并合成3个小干扰RNA(siRNA),转染胰腺癌BxPC-3细胞,采用荧光实时定量PCR方法筛选下调效果最好的siRNA。(3)采用Prrx1基因过表达慢病毒载体转染胰腺癌BxPC-3细胞,构建稳定高表达Prrx1基因过表达细胞(简称为Prrx1过表达细胞),分别采用荧光实时定量PCR和Western Blot方法检测癌细胞Prrx1基因(?)RNA和蛋白水平;采用显微镜观察癌细胞形态;分别采用Western Blot和免疫荧光方法检测各组癌细胞中E-cadherin和Vimentin蛋白情况;采用平板克隆方法观察癌细胞增殖情况,采用划痕修复试验观察癌细胞迁移情况,采用Transwell方法观察癌细胞侵袭能力;(4)采用Prrxl基因siRNA转染Prrx1过表达细胞后,分别采用荧光实时定量PCR和Western Blot方法检测癌细胞Prrx1基因nRNA和蛋白水平;采用显微镜观察癌细胞形态;分别采用Western Blot方法和免疫荧光方法检测各组癌细胞中E-cadherin和Vimentin蛋白情况;采用平板克隆方法观察癌细胞增殖情况,采用划痕修复试验观察癌细胞迁移情况,采用Transwell方法观察癌细胞侵袭能力。(5)癌细胞发生EMT涉及许多信号途径,为了进一步了解Prrx1基因调控癌细胞中生物学行为的分子机制,本研究进一步以BxPC-3过表达细胞为对照组,试验组分别采用]PI3K-Akt通路抑制齐JLY294002、NF-κB通路抑制剂PDTC以及Wnt通路抑制剂XAV939处理Prrx1 BxPC-3过表达细胞后,采用Western Blot方法检钡Prrx1和EMT相关分子的蛋白表达情况,从而初步探讨Prrx1通过哪些通路诱导EMT发生。结果(一)临床组织学研究结果 研究发现,胰腺癌组织中Prrx1蛋白阳性表达率较慢性胰腺炎和正常胰腺组织显著升高(尸值均<0.05),并与患者年龄、肿瘤脉管淋巴管侵犯、淋巴结转移、TNM分期及5年生存率相关(P值均<0.05),而与患者性别、肿瘤位置、分化程度及肿瘤的浸润深度无关(P值均>0.05);进一步分析发现,Prrx1阳性表达与E-cadherin高表达之间呈负相关(P<0.01,R-0.401)。 Prrx1阳性表达与Vimentin高表达之间呈正相关(P<0.01,R0.361)。统计学分析结果提示,Prrx1基因过表达与EMT有关。(二)细胞学研究结果(1)培养人正常胰腺导管上皮细胞和3株胰腺癌细胞,采用Western Blot方法检测Prrx1蛋白在细胞株中表达情况,结果发现:Prrx1蛋白在HPDE-C7细胞表达极低,而在AsPC-1、BxPC-3和CFPAC-1均高表达。我们选取BxPC-1做进一步研究。(2)采用荧光实时定量PCR和Western Blot方法检测发现,筛选下调效果最好的siRNA。结果发现,以siRNA-b下调Prrx1基因效果最好。本研究将采用siRNA-b为工具,观察siRNA-b转染对Prrx1过表达细胞株生物学行为的影响及分子机制。(3)成功构建了稳定过表达Prrx1胰腺癌BxPC-3细胞(简称Prrxl过表达细胞)。采用荧光实时定量PCR和Western Blot方法检测发现,与空白对照组比较,Prrx1过表达组细胞Prrx1基因nRNA和蛋白水平明显升高;形态学观察发现,Prrx1基因过表达组细胞由鹅卵石形变为纺锤形,即出现EMT改变;Western blot结果显示,与空白对照组比较,Prrx1过表达组细胞上皮标志物E-Cadherin表达下调,间叶标记物Vimentin表达上调;免疫荧光结果进一步证实了过表达Prrx1:造成E-cadherin下调及Vimentin上调。以上结果表明Prrx1过表达能促进胰腺癌细胞EMT的发生,提示Prrx1基因过表达组细胞发生了EMT。(4)平板克隆试验、划痕修复试验和Transwell方法检测发现,与空白对照组比较,Prrx1基因过表达组细胞增殖、迁移和侵袭能力明显升高。(5)采用siRNA-b转染Prrx1过表达细胞后,分别采用荧光实时定量PCR和Western Blot方法检测发现,与Prrx1过表达组比较,siRNA转染组细胞Prrx1基因]mRNA和蛋白水平明显下调,说明转染成功;形态学观察发现,Prrx1基因过表达组细胞纺锤形变为鹅卵石形,即EMT现象出现逆转;Western blot结果显示,与Prrx1过表达组比较,siRNA组细胞上皮标志物E-Cadherin表达升高,间叶标记物Vimentin表达降低;免疫荧光结果进一步证实了siRNA转染造成E-cadherin升高及Vimentin降低。以上结果表明,采用siRNA下调Prrx1基因表达后,Prrx1过表达细胞EMT出现逆转。(6)平板克隆试验、划痕修复试验和Transwell方法检测发现,与]Prrx1过表达组比较,siRNA转染组细胞增殖、迁移和侵袭能力明显降低。(7)信号通路抑制试验证实,Prrx1至少可通过NF-κB和Wnt两条信号通路介导胰腺癌细胞发生EMT。结论(1) Prrx1基因与胰腺癌细胞侵袭转移密切相关,可能是一种新的胰腺癌转移促进因子。(2) Prrx1通过诱导EMT发生,增强胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。(3) NF-κB和Wnt信号途径的激活,参与了Prrx1调控胰腺癌细胞发生EMT。
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